Mục đích và nguyên tắc
Hình 2.7. Tế bào nhuộm với Trypan blue quan sát trong buồng đếm hồng cầu
Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm Trypan blue để nhuộm tế bào nhằm phân biệt tế bào sống và tế bào chết, quan sát trong buồng đếm hồng
cầu. Trypan blue là thuốc nhuộm màu xanh dương chỉ có khả năng đi xuyên qua màng tế bào đã mất tính bán thấm. Do đó, khi dịch huyền phù tế bào được hòa trộn chung với Trypan blue, những tế bào sống có màng còn nguyên vẹn không hấp thụ được Trypan blue nên tế bào sẽ có hình dạng tròn, sáng và không bắt màu xanh. Ngược lại, những tế bào chết màng bị hư tổn, sẽ hấp thu thuốc nhuộm và có màu xanh khi quan sát dưới kính hiển vi (hình 2.7).
Thí nghiệm được tiến hành như sau:
Lau sạch bề mặt buồng đếm hồng cầu và lamelle với cồn 70%. Phải đảm bảo buồng đếm sạch, khô, không dính vết, dấu tay hoặc nước. Đặt lamelle bao phủ toàn bộ bề mặt vùng đếm của buồng đếm.
Pha loãng dịch huyền phù tế bào (thu từ bước huyền phù tế bào trong cấy chuyền) 2 lần với Trypan blue bằng cách trộn 25 µl dịch huyền phù tế bào với 25 µl Trypan blue 0,4%.
Chú ý : Khi sử dụng buồng đếm hồng cầu, lượng tế bào tối đa cho
1mm2 ô đếm là 50 - 100 tế bào. Pha loãng tế bào nếu cần thiết để thu được dịch huyền phù tế bào đồng nhất.
Chuyển dịch tế bào đã huyền phù trong Trypan blue vào cạnh buồng đếm, bơm nhẹ, dịch tế bào sẽ tự dàn đều trên bề mặt buồng đếm dưới lamelle phủ nhờ lực mao dẫn.
Quan sát tế bào dưới kính hiển vi, vật kính 10X.
Đếm tế bào ở 4 ô ở góc (A, B, C, D) và ô trung tâm (E) trong buồng đếm hồng cầu (hình 2.8). Mỗi ô lớn này được chia làm 16 ô nhỏ hơn. Tế bào trong các vùng đếm này nên được phân bố đều, không đóng cục. Nếu tế bào không phân bố đều, rửa buồng đếm và làm lại. Các tế bào sống sẽ sáng rõ (không được nhuộm), các tế bào chết sẽ bị nhuộm xanh.
Chú ý : Đếm các tế bào ở bên trong, chạm giữa đường kẻ trên và bên trái hình vuông. Không đếm những tế bào chạm giữa đường kẻ ở dưới và bên phải hình vuông.
Công thức tính mật độ tế bào
M = (A/5) × 104× độ pha loãng
Với: M: mật độ tế bào (tế bào/ml);
A: số tế bào đếm được trong 5 ô lớn.