Hiện nay có khá nhiều phương pháp để khảo sát tác động kháng phân bào của các hoạt chất tự nhiên như :
Phương pháp Trypan Blue (Trypan Blue exclusion assay)
Phương pháp MTT (MTT assay)
Phương pháp SRB (SRB assay)
Phương pháp Clonogenic (Clonogenic assay)
Phương pháp Xcelligence (Xcelligence assay)
Tuy nhiên, trong đề tài này sẽ sử dụng phương pháp MTT để đánh giá tác động kháng phân bào bởi những ưu điểm như:
Có tính ứng dụng cao, áp dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Sự đo lường chính xác thông qua phép đo quang phổ.
Thuốc thử an toàn, không kích hoạt chất phóng xạ bằng tay.
Dễ sử dụng, thao tác đơn giản và nhanh, sử dụng những thiết bị hầu như có sẵn trong các phòng thí nghiệm.
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Tế bào
Dòng tế bào ung thư vú MCF-7
Dòng tế bào xuất xứ từ một phụ nữ da trắng 69 tuổi bị ung thư vú di căn vào năm 1970, cung cấp bởi Viện ung thư Quốc Gia Hoa Kỳ (NCI - Frederick, MD, USA); được mua từ A T C C bảo quản và nuôi cấy tại phòng thí nghiệm Tế bào gốc - trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp. Hồ Chí Minh.
Tế bào ung thư vú MCF-7, được thể hiện trên hình 2.1.
Hình 2.1. Tế bào MCF – 7 2.1.2. Hóa chất
a. Dùng để chiết xuất cao chiết Xáo tam phân
Methanol (J. T. Baker, Hoa Kỳ). Nước cất.
b. Dùng trong nuôi cấy tế bào Môi trường nuôi cấy
Dòng tế bào được nuôi trường DMEM (Dullbecco’s Modified Eagle Medium) bổ sung huyết thanh bò 10%, dung dịch kháng sinh và kháng nấm 1% (penicillin 50,000 units/l và streptomycin 50 mg/l) (ký hiệu: DMEM/ F12/ 10% FBS/ 1% anti). Tế bào được cấy chuyền khi phát triển bao phủ bề mặt bình nuôi cấy khoảng 70 - 80%.
Dung dịch đệm PBS (-) 1X
Dung dịch đệm PBS (-) là dung dịch muối được sử dụng để rửa tế bào. Dung dịch PBS (-) dùng trong nuôi cấy tế bào không chứa ion Ca2+ và Mg2+ được gọi là PBS (-).
Dung dịch Trypsin/EDTA
Trypsin là một protease có tác dụng thủy phân các protein liên kết giữa các tế bào với nhau và các protein giúp tế bào bám lên bề mặt bình Roux. EDTA (muối disodium của ethylenediamintetra-acetic acid) có vai trò bắt các ion Ca2+ làm tăng tính ổn định của tế bào, làm tế bào dính chặt vào đáy bình Roux hơn.
Trypsin/EDTA là dung dịch dùng để tách tế bào ra khỏi đáy bình Roux và làm cho chúng rời nhau ra, sử dụng trong thao tác cấy chuyền và bảo quản tế bào. Ngoài ra, dung dịch Trypsin/EDTA còn được sử dụng để rửa tế bào NCI-H460.
Dung dịch Trypan blue 0,4% (w/v) (Cambrex)
Trypan blue là một dẫn xuất của toluidine, là thuốc nhuộm được sử dụng để nhuộm chọn lọc mô hay tế bào chết. Ở những tế bào sống, màng tế bào còn nguyên vẹn nên Trypan blue không có khả năng thấm qua màng. Ở những tế
bào chết, màng bị tổn thương nên Trypan blue đi qua và nhuộm màu xanh. Tế bào sống và chết sẽ được phân biệt dưới kính hiển vi quang học qua màu nhuộm.
Dimethyl sulphoxide (DMSO)
DMSO là dung môi lưỡng tính (dipolar aprotic solvent), nó vừa có tính phân cực như các dung môi hữu cơ thông thường: alcol, ester, ketone chlorinate và những hydrocarbon thơm, vừa có tính phân cực như nước. Ngoài ra, nó còn ổn định với hầu hết acid và bazơ như: hydroxide, alkoxide, ammonium và các amon. Đây là tính đa dụng của DMSO khi được sử dụng làm dung môi. Ngoài ra, DMSO còn có khả năng mang thuốc xuyên qua màng tế bào.
Thuốc thử chuẩn Doxorubicin (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Doxorubicin là một kháng sinh thuộc nhóm anthracyclin gây độc tế bào được phân lập từ môi trường nuôi cấy Streptomyces peucetius var. caecius. Hiện nay, Doxorubicin được tổng hợp từ daunorubicin.
Doxorubicin kích ứng mạnh các mô và có thể gây hoại tử mô, ví dụ trong trường hợp tiêm ra ngoài mạch máu.
Hoạt tính sinh học: doxorubicin gắn vào DNA làm ức chế các enzym cần thiết để sao chép và phiên mã DNA. Doxorubicin gây gián đoạn mạnh chu kỳ phát triển tế bào ở giai đoạn phân bào S và giai đoạn gián phân, nhưng thuốc cũng tác dụng trên các giai đoạn khác của chu kỳ phát triển tế bào. Vì thế, doxorubicin được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu về các dòng tế bào ung thư vú.
2.1.3. Thiết bị
Tủ nuôi tế bào (37°C, 5% CO2) C150 Binder (Đức) (hình 2.2). Nồi hấp tiệt trung (autoclave) HV 85 Hirayama (Nhật Bản). Kính hiển vi soi ngược Axiovert 40 C Zeiss (Đức).
Kính hiển vi quang học Primo Star Zeiss (Đức) (hình 2.3) . Tủ lạnh GS-S402S LG (Hàn Quốc).
Hình 2.2. Tủ nuôi tế bào Hình 2.3. Kính hiển vi quang học
Hình 2.4. Máy ly tâm Hình 2.5. Máy đo OD
Máy ly tâm Allegra X-15R Centrifuge Beckman Coulter - Hoa Kỳ (hình 2.4).
Máy đo OD (Multimode detector-microplate reader) DTX 880 Beckman Coulter (Hoa Kỳ) (hình 2.5).
Bể ổn nhiệt (Water Bath) Memmert ® Excellent WNE7.
2.1.4. Dụng cụ
Buồng đếm Neubauer và lamelle (Marienfeld, Đức). Bình Flask nuôi cấy tế bào T25, T75 ( Corning, Hoa Kỳ). Đĩa 96 giếng (SPL Lifesciences, Hàn Quốc).
Bình duran 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml (Schott, Đức). Falcon 15 ml, 50 ml (Corning, Hoa Kỳ).
Eppendorf 1,5 ml (Eppendorf, Đức).
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Tổng quát nghiên cứu
Tổng quát nghiên cứu được thể hiện trên hình 2.6
2.2.2. Nuôi và bảo quản tế bào
Mục đích: Duy trì dòng tế bào MCF – 7 cung cấp cho thí nghiệm.
Quy trình đông lạnh tế bào
Hút bỏ môi trường cũ có trong flask nuôi tế bào. Tráng PBS để làm sạch Flask, sau đó hút bỏ.
Cho 0,5 ml Trypsin vào Flask để tách tế bào, ủ trong vòng 3 phút ở tủ ấm.
Cho 1ml môi trường DMEM vào để bất hoạt Trypsin.
Cho tất cả vào falcon 15 ml.
Tráng lại flask bằng PBS, rồi cho vào falcon. Ly tâm falcon 2500 vòng/ phút trong 5 phút.
Lọc lấy cặn, thêm vào falcon 0,5 ml môi trường DMEM, huyền phù và cho vào cryotube.
Tếbào ung thư MCF-7 Khảo sát đường cong tăng trưởng Nuôi cấy tế bào Khảo sát thuốc thử Doxorubicin Khảo sát cao chiết Methanol
Xáo tam phân
Tếbào đối chứng ADSC - Nuôi cấy tế bào ở đĩa 96 giếng. Mật độ 1000 tế bào/ giếng. - Thực hiện bằng phương pháp đo MTT sau 24h mỗi lần đo trong 8 ngày. -Độ lặp lại thí nghiệm là 3 lần. - Nuôi cấy tế bào ở đĩa 96 giếng. Mật độ 1000 tế bào/ giếng. - Nồng độ thuốc khác nhau: 2; 1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,0625; 0,03125 µM - Thực hiện bằng phương pháp đo MTT sau 48h xử lý thuốc. Độ lặp lại thí nghiệm là 3 lần. - Nuôi cấy tế bào ở đĩa 96 giếng. Mật độ 1000 tế bào/ giếng. - Nồng độ cao chiết khác nhau: 100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 µg/ 100µl. - Thực hiện bằng phương pháp đo MTT sau 48h xử lý thuốc. Độ lặp lại thí nghiệm là 3 lần. - Xây dựng được (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
đường cong tăng trưởng.
-Xác định thời
gian nhân đôi.
Xác định nồng độ IC50 của thuốc Xác định nồng độ IC50 của cao chiết Nuôi cấy tế bào ở đĩa 96 giếng. Mật độ 1000 tế bào/ giếng Đánh giá tác động cao chiết ở nồng độ IC50 - Xây dựng được
đường cong tăng trưởng.
-Xác định thời
gian nhân đôi.
So sánh kết quả 2 thí nghiệm
Thêm 0,5ml môi trường đông lạnh vào cryotube một cách từ từ từng giọt Ủ cryotube ở 4°C trong 30 phút, sau đó ủ trong -20°C trong 3 - 4 tiếng, sau đó để ở -80°C trong 12 tiếng, cuối cùng đem vào cất trong Nitơ lỏng (- 180°C).
Quy trình giải đông tế bào
Chuyển cryotube chứa tế bào từ bình nitơ lỏng hay tủ -80°C lập tức vào water bath ở 36 - 38°C, đến khi dịch còn chút tinh thể bằng 1/10 tổng thể tích thì đem vào tủ ATSH.
Huyền phù dịch tế bào trong cryotube đều tay và nhẹ nhàng, cho vào falcon 15 ml, bổ sung môi trường giải đông một cách từ từ để tránh gây sốc tế bào với tỉ lệ 1:1 hoặc 1:2 so với thể tích môi trường.
Ly tâm ở 200 vòng/ phút trong 5 phút, lọc thu cặn.
Thêm môi trường và huyền phù đề tay một cách nhẹ nhàng. Cấy tế bào vào các Flask nuôi tế bào.
Nuôi trong tủ nuôi tế bào ở 37°C, 5% CO2.
Sau 4 tiếng quan sát tế bào dưới kính hiển vi đánh giá sức khỏe của tế bào.
Thay môi trường.
Quy trình thay môi trường
Hút bỏ môi trường cũ ra khỏi Flask.
Tráng PBS để làm sạch Flask, sau đó hút bỏ.
Thêm môi trường mới vào mỗi Flask (Flask T25 2,5 ml, Flask T75 7,5 ml).
Nuôi trong tủ nuôi tế bào.
Quy trình cấy chuyền
Tráng PBS để làm sạch Flask, sau đó hút bỏ.
Cho 0,5 ml Trypsin vào Flask để tách tế bào, ủ ở tủ ấm trong 3 phút. Cho 1 ml môi trường DMEM vào để bất hoạt Trypsin.
Cho tất cả vào falcon 15 ml.
Tráng lại Flask bằng PBS, rồi cho vào falcon. Ly tâm falcon 2500 vòng/phút trong 5 phút.
Lọc lấy cặn, cho vào falcon lượng môi trường DMEM cần thiết cho số lượng Flask cấy chuyền, huyền phù đều tay.
Cho vào các Flask, đem quan sát tế bào dưới kính hiển vi.
Nuôi tế bào trong tủ nuôi tế bào. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.3. Phương pháp đếm tế bào với Trypan blue
Mục đích và nguyên tắc
Hình 2.7. Tế bào nhuộm với Trypan blue quan sát trong buồng đếm hồng cầu
Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm Trypan blue để nhuộm tế bào nhằm phân biệt tế bào sống và tế bào chết, quan sát trong buồng đếm hồng
cầu. Trypan blue là thuốc nhuộm màu xanh dương chỉ có khả năng đi xuyên qua màng tế bào đã mất tính bán thấm. Do đó, khi dịch huyền phù tế bào được hòa trộn chung với Trypan blue, những tế bào sống có màng còn nguyên vẹn không hấp thụ được Trypan blue nên tế bào sẽ có hình dạng tròn, sáng và không bắt màu xanh. Ngược lại, những tế bào chết màng bị hư tổn, sẽ hấp thu thuốc nhuộm và có màu xanh khi quan sát dưới kính hiển vi (hình 2.7).
Thí nghiệm được tiến hành như sau:
Lau sạch bề mặt buồng đếm hồng cầu và lamelle với cồn 70%. Phải đảm bảo buồng đếm sạch, khô, không dính vết, dấu tay hoặc nước. Đặt lamelle bao phủ toàn bộ bề mặt vùng đếm của buồng đếm.
Pha loãng dịch huyền phù tế bào (thu từ bước huyền phù tế bào trong cấy chuyền) 2 lần với Trypan blue bằng cách trộn 25 µl dịch huyền phù tế bào với 25 µl Trypan blue 0,4%.
Chú ý : Khi sử dụng buồng đếm hồng cầu, lượng tế bào tối đa cho
1mm2 ô đếm là 50 - 100 tế bào. Pha loãng tế bào nếu cần thiết để thu được dịch huyền phù tế bào đồng nhất.
Chuyển dịch tế bào đã huyền phù trong Trypan blue vào cạnh buồng đếm, bơm nhẹ, dịch tế bào sẽ tự dàn đều trên bề mặt buồng đếm dưới lamelle phủ nhờ lực mao dẫn.
Quan sát tế bào dưới kính hiển vi, vật kính 10X.
Đếm tế bào ở 4 ô ở góc (A, B, C, D) và ô trung tâm (E) trong buồng đếm hồng cầu (hình 2.8). Mỗi ô lớn này được chia làm 16 ô nhỏ hơn. Tế bào trong các vùng đếm này nên được phân bố đều, không đóng cục. Nếu tế bào không phân bố đều, rửa buồng đếm và làm lại. Các tế bào sống sẽ sáng rõ (không được nhuộm), các tế bào chết sẽ bị nhuộm xanh.
Chú ý : Đếm các tế bào ở bên trong, chạm giữa đường kẻ trên và bên trái hình vuông. Không đếm những tế bào chạm giữa đường kẻ ở dưới và bên phải hình vuông.
Công thức tính mật độ tế bào
M = (A/5) × 104× độ pha loãng
Với: M: mật độ tế bào (tế bào/ml);
A: số tế bào đếm được trong 5 ô lớn.
2.2.4. Khảo sát tác động các loại cao chiết khác nhau lên sựtăng sinh của
tế bào ung thư MCF-7
Quy tắc phương pháp MTT
MTT là phương pháp so màu để đo hoạt động của enzyme làm biến đổi muối tetrazolium (MTT) có màu vàng, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl), 2,5- diphenyl tetrazolium bromide, thành formazan có màu tím, nhằm xác định số lượng tế bào sống trong các nghiên cứu về sự tăng trưởng và độc tính tế bào. Phương pháp dựa trên sự cắt đứt muối tetrazolium màu vàng (MTT) thành sản phẩm formazan màu xanh hòa tan bởi các enzyme trong ty thể. Lượng formazan tạo thành tỷ lệ với số tế bào sống hiện diện trong suốt quá trình tiếp xúc với MTT. Phương pháp MTT là phương pháp thực hiện nhanh, thuận tiện
và kinh tế nên nó là một phương pháp phổ biến để định lượng các tế bào sống trong nuôi cấy. Tuy nhiên, các thông số khác nhau được xác định có thể tác động đến sự biến dưỡng của tế bào và các yếu tố khác khiến hoạt động chuyên biệt của MTT biến đổi và làm sai lệch kết quả. Do đó, cần thiết lập các thông số để kiểm soát phù hợp cho mỗi dòng tế bào hoặc mỗi cách xử lý thuốc để tối ưu hóa điều kiện phân tích và giảm thiểu các tác động xấu. Các thông số này bao gồm: xác định mật độ tế bào thích hợp, môi trường nuôi cấy, nồng độ tối ưu và thời gian tiếp xúc với MTT, dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy, kiểm soát các tác động xử lý thuốc có thể ảnh hưởng đến sự biến dưỡng tế bào. Bằng cách kiểm soát những thông số quan trọng này, phương pháp MTT cung cấp số lượng tế bào ống chính xác và tin cậy.
Hình 2.9. Sự biến đổi của MTT dưới tác động của enzyme trong ty thể
Thực hiện:
Xây dựng đường cong tăng trưởng theo phương pháp MTT
Chọn Flask có mật độ tế bào cao, tách tế bào bằng Trypsin- EDTA 0,25%. Ly tâm và thu cặn tế bào.
Xác định mật độ tế bào trong dịch huyền phù bằng buồng đếm Neubauer.
Điều chỉnh mật độ tế bào của dịch huyền phù khoảng 104 tế bào/ ml và cấy vào các giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng 100 µl. Cần đảm bảo huyền
phù thật đều để số lượng tế bào trong các giếng đều nhau. Đặt đĩa vào tủ nuôi 37°C, 5% CO2. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau 24h, thêm vào 10 µl MTT vào 3 giếng của từng ngày, ủ trong tủ nuôi. Sau 4h hút hết toàn bộ dung dịch có trong 3 giếng ra ngoài và thêm vào 100 µl DMSO để hòa tan tinh thể MTT, lắc 50 vòng/ phút trong vòng 10 phút.
Đo OD và thu số liệu trên máy đo OD DTX 880.
Thực hiện trong 8 ngày liên tiếp. Xây dựng đường cong tăng trưởng.
Khảo sát thuốc thử chuẩn Doxorubicin trên dòng tế bào MCF – 7
Thực hiện song song cùng thí nghiệm xây dựng đường cong tăng trưởng của dòng tế bào MCF - 7 là thí nghiệm khảo sát IC50 của thuốc thử Doxorubicin trên dòng tế bào MCF - 7.
Cũng như thí nghiệm xây dựng đường cong tăng trưởng, thì mật độ tế bào của dịch huyền phù cũng là 104 tế bào/ ml, mỗi giếng được cấy 100 µl dịch.
Đến ngày thứ 3 bắt đầu thay môi trường có bổ sung thuốc thử Doxorubicin với các nồng độ khác nhau 2; 1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,0625; 0,03125 µM vào lần lượt các giếng tương ứng, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Lúc này, mật độ tế bào có trong mỗi giếng sẽ khoảng 5 x 104 tế bào/ ml.
Thêm 10 µl MTT vào mỗi giếng cần đo, ủ trong tủ nuôi trong vòng 4h. Sau đó hút toàn bộ dịch có trong các giếng ra ngoài và thêm 100 µl DMSO để hòa tan tinh thể MTT, lắc 50 vòng/ phút trong vòng 10 phút.
Đo OD bằng máy đo DTX 880.
Đánh giá kết quả.
Thực hiện tạo dịch huyền phù tế bào có mật độ 5×104 tế bào/ ml.
Cấy vào mỗi giếng trong đĩa 96 giếng 100 µl dịch huyền phù tế bào, đặt đĩa vào tủ nuôi 37°C, 5% CO2 cho các tế bào ổn định.
Sau 24h thay môi trường cũ bằng môi trường mới chứa cao chiết theo nồng độ 100; 50; 25; 12,5; 6,25 và 3,125 μg/ μl môi trường nuôi.
Thêm 10µl MTT vào mỗi giếng cần đo, ủ trong tủ nuôi trong vòng 4h. Sau đó hút toàn bộ dịch có trong các giếng ra ngoài và thêm 100 µl DMSO để hòa tan tinh thể MTT, lắc 50 vòng/ phút trong vòng 10 phút.
Đo OD bằng máy đo DTX 880.