Dựa vào phương pháp nghiên cứu vi khuẩn ở cá và động vật thủy sản của Millar và Frerichs. (1993)
Hình 2.2: Sơđồ nghiên cứu phân lập vi khuẩn
Mẫu cá bệnh
Thu mẫu bệnh phẩm
Nuôi cấy, phân lập
Nhuộm Gram
Thử các phản ứng sinh hóa Hình thái khuẩn lạc
* Cấy vi khuẩn
Cấy chọn khuẩn lạc : Phương pháp thường dùng là cấy ria, mục đích là làm cho khuẩn lạc đứng riêng rẽ.Ta tiến hành đốt nóng đỏ que cấy sau mỗi vùng cấy để làm cho mật độ vi khuẩn giảm dần, mỗi tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ sẽ phát triển thành một khuẩn lạc sau thời gian nuôi cấy.
Nuôi vi khuẩn : Mẫu bệnh phẩm thu được nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 29oC sau 24 – 48 giờ kiểm tra hình thái khuẩn lạc, chọn khuẩn lạc để cấy tiếp lên môi trường tăng sinh. Sau 24 giờ nuôi cấy nhuộm gram, nếu được vi khuẩn thuần tiến hành thử các phản ứng sinh hóa theo bộ kít API 20E hoặc API 20STREP và một số phản ứng sinh hóa truyền thống cần thiết cho việc định danh vi khuẩn.
* Nghiên cứu hình thái vi khuẩn :
Sử dụng phương pháp nhuộm Gram
- Sau khi được giống vi khuẩn thuần, lấy mẫu phết lên lam, cho 01 giọt nước muối sinh lý vô trùng, dùng que cấy dàn mỏng trên lam kính.
- Hơ cao lam kính có mẫu trên ngọn lửa đèn cồn, để cố định và diệt vi khuẩn. - Nhỏ tiếp dung dịch 1 (tím tinh thể) lên tiêu bản, để yên 30-60 giây.
- Rửa nước nhanh, vẩy khô.
- Nhỏ dung dịch 2 (Lugol) để cố định trong 1 phút (tiêu bản có màu đen). - Rửa nước nhanh, vẩy khô.
- Nhỏ dung dịch 3 (Cồn Aceton) để nghiêng đầu một bên lam để cồn chảy qua chỗ phết vi khuẩn, nhằm tẩy màu.
- Rửa nước nhanh, vẩy khô.
- Nhỏ dung dịch 4 (Safranin) để cố định 1 đến 2 phút.
- Rửa nước, để khô hoặc dùng giấy thấm khô, không được để xước mẫu. - Soi dưới kính hiển vi bằng vật kính dầu (độ phóng đại x1000).
Dưới kính hiển vi ta có thể xác định được vi khuẩn gram âm bắt màu hồng và gram dương bắt màu xanh tím. Khi được vi khuẩn thuần tiến hành nuôi vi khuẩn trong môi trường lỏng trypton, để có dung dịch ở dạng huyền phù thử phản ứng sinh hóa.
* Thử phản ứng sinh hóa bằng bộ kít API 20E
- Nguyên lý
Phương pháp này dùng 21 tiêu chuẩn thử sinh hóa cho phép định tên một số loài vi khuẩn hình que, gram âm và thuộc họ Enterobacteriaceae.
Kít thử API 20E gồm có các ống nghiệm nhỏ trong có chứa các chất nền đã khử nước. Trong quá trình ủ, hoạt động của vi khuẩn sẽ làm chuyển màu hoặc làm đục môi trường. Sau 24h đọc các phản ứng đối chiếu theo bảng kết quả để định tên.
- Các bước phân lập vi khuẩn theo kit API 20E
Hình 2.3: Qui trình thử kít API 20E
- Chuẩn bị kit
+ Chuẩn bị hộp ủ và đổ 5ml nước cất (hoặc nước khử khoáng) vào chỗ lõm để tạo hơi ẩm
- Chuẩn bị mẫu
OF-F OF-O ONPG ADH LDC OCD CIT H2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA
Qui trình thử kít API 20E
1 2
3 4
+ Kít thử API 20E không dùng trực tiếp các mẫu bệnh phẩm
+ Thu mẫu bệnh phẩm, cấy lên môi trường chọn lọc. Sau đó tiến hành chọn khuẩn lạc để nuôi thuần; sau 24h hay 48h nuôi cấy, lấy vi khuẩn thuần để pha loãng thành dịch huyền phù bằng 5ml NaCl 1,5%.
Chuẩn bị ủ
+ Dùng một pipet lấy dịch huyền phù vi khuẩn cho đầy vào các ống.
+ Đổ 1 lớp dầu vào các ống thử có ngạch chân ở dưới( ADH, LDC, ODC, H2S, URE) để tạo môi trường yếm khí.
+ Đổ đầy dịch huyền phù vi khuẩn vào cả ống và cốc (CIT, VP, GEL) + Thử thêm ngoài trên 2 ống O/F
Ủ mẫu
+ Ủ các mẫu phản ứng đó ở nhiệt độ 27 - 290C thời gian 24 - 48h.
Đọc kết quả
Đọc kết quả theo bảng đọc và dùng các thuốc thử hiển thị kết quả:
+ Thử TDA: Cho 1 giọt thuốc thử TDA chuyển màu nâu đỏ là dương tính. + Thử IND: Cho 1 giọt thuốc thử JAMES phát triển màu hồng trong ống thử là dương tính.
+ Thử VP: Cho 1 giọt thuốc thử VP 1 và 1 giọt thuốc thử VP 2, đợi ít nhất 10 phút chuyển màu hồng hoặc đỏ là dương tính. Nếu chuyển màu hồng nhẹ sau 10 phút là âm tính.
+ Thử NO2: Cho 1 giọt NIT 1 và 1 giọt NIT 2 vào ống GLU. Đợi sau 2 - 5 phút chuyển màu đỏ là dương tính. Chuyển màu vàng có thể chúng khử đến N2 (1 số trường hợp sinh hơi ở đáy) cho thêm 2-3mg Zn vào ống GLU. Sau 5 phút nếu ống chuyển lại màu vàng là phản ứng sinh khí N2 là dương tính; nếu ống chuyển màu da cam đến đỏ là âm tính.
+ Đối với môi trường OF: Dùng que cấy đã được hơ nóng và để nguội, lấy vi khuẩn và chọc thẳng vào ống nghiệm chứa môi trường OF, nuôi trong tủ ấm 24 giờ và đọc kết quả.
* Thử phản ứng sinh hóa bằng kit thử API 20 STREP
Các bước tiến hành tương tự bộ kít thử API 20E nhưng dùng để định danh các loại vi khuẩn.
* Phân loại vi khuẩn:
- Theo tiêu chuẩn chung: đi từ họ, giống đến tiêu chuẩn đặc trưng cho loài. - Dựa vào những đặc điểm và kết quả thử phản ứng sinh hoá, phân loại vi khuẩn dựa vào bảng phân loại vi khuẩn, cẩm nang phân loại vi khuẩn của Frerichs (1984) và Nicky B. Buller (2004).
* Tần số bắt gặp các loài vi khuẩn
Tần số bắt gặp các loài vi khuẩn được tính theo công thức: