- Chuẩn bị đĩa giấy kháng sinh cho các loại kháng sinh cần thử nghiệm (Hàm lượng kháng sinh trên mỗi đĩa giấy kháng sinh được chuẩn bị theo đĩa giấy kháng sinh đã thương mại hóa).
+ Tiến hành thử riêng kháng sinh đồ đối với vi khuẩn thu được trên cá bệnh + Môi trường MHA 1,5% NaCl được đổ trên đĩa petri, trang vi khuẩn lên các
đĩa petri đã chuẩn bị.
+ Đặt các khoanh giấy kháng sinh lên, đưa vào tủ ấm 27-29oC
+ Đọc kết quả đo đường kính vô khuẩn sau 24h.
- Xác định tính mẫn cảm của vi khuẩn với các chất kháng sinh
+ Sử dụng phương pháp khuyếch tán trong thạch thịt của vi khuẩn với các đĩa
giấy kháng sinh tiêu chuẩn (CODE 1334E-OXOID)
+ Dựa vào đường kính vòng vô khuẩn, xác định tính mẫn cảm của vi khuẩn với
chất kháng sinh
° Đường kính vòng vô khuẩn > 20mm: Vi khuẩn có tính mẫn cảm cao
° Đường kính vòng vô khuẩn 11- 20mm: Vi khuẩn có tính mẫn cảm trung bình ° Đường kính vòng vô khuẩn <11mm: Vi khuẩn có tính mẫn cảm kém
° Đường kính vòng vô khuẩn 6mm: Vi khuẩn không có tính mẫn cảm
2.2.7 Phương pháp xử lý số liệu
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả phân tích tác nhân gây bệnh
3.1.1. Dấu hiệu bệnh lý vi khuẩn gây bệnh trên cá chẽm nuôi trong ao đất tại Hải Phòng
Kết quả quan sát mẫu cá bệnh thu được trong quá trình thu mẫu có một hoặc nhiều dấu hiệu như: Cá yếu, bỏ ăn, bơi lờ đờ, thân màu đen xám, bụng xuất huyết, hậu môn xuất huyết hoặc sưng, thân cá có vết loét, mắt mờ đục . Giải phẫu bên trong thấy xoang bụng chứa nhiều dịch; gan xuất huyết; thận sưng xuất huyết.
Theo Phan Thị Vân và cộng sự, 2006, bệnh lở loét, xuất huyết do vi khuẩn trên cá biển do tác nhân gây bệnh là Vibrio spp (V. alginolyticus, V. parahaemolyticus và
V. vulnificus); Pseudomonas; Streptococcus sp với các dấu hiệu cá kém ăn hoặc bỏ ăn,
cá bơi trên tầng mặt và quanh thành lồng. Trên thân cá thường xuất hiện các vết loét tấy đỏ to nhỏ khác nhau, xung quanh da phồng lên và có nhiều nhớt. Giải phẫu cá bệnh các cơ quan nội tạng gan, thận, lá lách có hiện tượng xuất huyết, ruột, dạ dày không có thức ăn. Bệnh thường gặp ở cá chẽm, cá song khi mới vận chuyển ra lồng lưới nuôi. Mùa vụ phát bệnh mùa xuân, hè. Kết hợp với môi trường thay đổi đột ngột, sau các
và chết nhiều hơn, đặc biệt cá giống mới thu gom vào lồng tỷ lệ chết rất cao. Cá bị bệnh sau 1-2 tuần có thể chết rải rác, tỷ lệ chết 10-30 %.
3.1.2. Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh trên cá chẽm nuôi trong ao đất tại Hải Phòng.
Từ 120 mẫu cá chẽm bị bệnh đề tài thu được 04 loài vi khuẩn. Bằng việc thực hiện các phản ứng sinh hóa theo bộ kít định danh API 20E, kết hợp với tài liệu định danh vi khuẩn “Bergey’s manual of determinative bacteriology” của Jonhn G. Holt và ctv (1994)[40], đề tài đã xác định cấp độ loài của các chủng vi khuẩn phân lập được như sau:
Bảng 3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn
TT Địa điểm thu
mẫu Số mẫu Kết quả phân lập vi khuẩn Tỷ lệ nhiễm 1 Dương Kinh 30 V. alginolyticus 15/30 50 % Pseudomonas sp 5/30 16,6% 2 Cát Hải 30 V. alginolyticus 17/30 76,6% V. vulnificus 11/30 36,7% Pseudomonas sp 7/30 23,3% 3 Thủy Nguyên 30 V. alginolyticus 12/30 40,0% Pseudomonas sp 6/30 20,0%
Hình 3.2: Tỷ lệ nhiễm các loài vi khuẩn
Từ kết quả phân lập, định danh vi khuẩn gây bệnh trên cá chẽm nuôi trong ao đất tại Hải Phòng thấy tỷ lệ nhiễm V.alginolyticus cao nhất (36,7%), tiếp đến
Pseudomonas sp (15%), V.vulnificus (9,2%), thấp nhất là Aeromonas sorbia (4,2%).
Vi khuẩn Aeromonas sorbia phân lập được từ các mẫu cá chẽm thu ở vùng nuôi cá
nước ngọt trên địa bàn thành phố.
Vibrio alginolyticus: V.alginolyticus được xác định là tác nhân thứ cấp tham gia gây bệnh đối với cá tráp (Sparus aurata) nuôi ở Israel khi loài cá này bị thương tổn (Colorni và cộng sự, 1981). Theo mô tả của Colorni và ctv (1981), Austin và ctv (1993) (trích dẫn bởi Austin B. và ctv, 2007), bệnh do V. alginolyticus gây ra có thể được liệt vào dạng bệnh vi khuẩn nhiễm trùng máu. Cá bị nhiễm bệnh thường trở nên chậm chạp, da trở nên xám đen, vảy bong và tróc, phát triển thành dạng lở loét. Gan, mao mạch trong da, bóng bơi, màng bụng trở nên sung huyết, ruột sưng phồng có dịch lỏng, biểu hiện thiếu máu và mang bị thối rữa cũng đã được báo cáo. Các nghiên cứu của Woo và ctv (1995), Ye và ctv (1997) (trích dẫn bởi Austin B. và ctv, 2007) cho
rằng V. alginolyticus là tác nhân gây chết nhiều ở cá tráp bạc (Sparus sarba) tại Hong Kong[29]. Một nghiên cứu khác của Balebona M. Carmen (1998) trên cá tráp đầu bạc (Sparusaurata L.) nuôi ở Tây Ban Nha cũng cho thấy V. alginolyticus là tác nhân
chính gây bệnh với LD50 từ 5,4 x 104 – 1 x 106 CFU/g cơ thể. Các dấu hiệu bệnh đặc trưng gây nên bởi tác nhân này như nhiễm trùng máu xuất huyết, cơ thể trở nên xám đen, một số trường hợp xuất hiện lở loét trên cơ thể, tích dịch ở màng bụng, gan xuất huyết[30]. Theo FAO, V. alginolyticus là tác nhân gây bệnh vi khuẩn da trên cá chẽm[36]. Theo Nguyễn Thị Thanh Thùy và ctv (2008), trên cá mú bị lở loét cũng bắt gặp loài vi khuẩn V. alginolyticus với tần suất bắt gặp là 50%[20].
Pseudomonas sp:. Giống Pseudomonas sp thường gặp các loài gây bệnh cho cá
như: P.anguilliseptica thường gây bệnh ở cá trích Baltic (Clupea harengus membras), cá tráp đầu bạc, cá tráp chấm đen, cá mú chấm cam…[29]; P. plecoglosicida: gây bệnh trên cá ayu (Plecoglossus altivelis) ở Nhật Bản; P. putida: gây lồi mắt và lở loét trên
cá hồi nuôi hồ ở Thổ Nhĩ Kỳ[29]. Nguyễn Thị Thanh Thùy và ctv (2008) cũng phân lập được vi khuẩn Pseudomonas sp trên cá mú bị bệnh lở loét, tuy nhiên tần số bắt gặp không nhiều[20].
Vibrio vulnificus: Theo các nghiên cứu trước đây, từ năm 1975 đến 1977, ở Nhật Bản có sự bùng nổ của bệnh ở cá chình nuôi tại 6 vùng khác nhau. Bệnh sau đó phổ biến ở các nước châu Âu là Tây Ban Nha, Hà Lan và Anh. Vi khuẩn gây nên các vết đỏ trên cơ thể, làm xuất huyết ở bên sườn và đuôi. Trong trường hợp nặng hơn, bệnh có thể thay đổi và xuất hiện trong ống ruột, mang, tim, gan và thận. Ở bên ngoài, dấu hiệu bệnh giống như bệnh vibriosis. Trong năm 2005, bệnh được ghi nhận là nguyên nhân gây chết nhiều ở cá nục hình trứng (Trachinotus ovatus) ở Trung Quốc, với các dấu hiệu bệnh bao gồm xuất huyết và lở loét bên ngoài và mang, ruột và gan cũng bị xuất huyết. Một type mới là V. vulnificus biotype 2 serova A được ghi nhận ở Tây Ban Nha từ năm 2000 và Đan Mạch năm 2004 gây bệnh trên cá chình từ 5 - 10 g làm hoại tử và xuất huyết[29].
Aeromonas sorbia : Aeromonas sorbia gây bệnh vi khuẩn nhiễm trùng máu xuất huyết, vi khuẩn này thường nhiễm ở cá chẽm nuôi nước ngọt, làm cho cá bị xuất huyết đỏ ở da, lờ đờ, cá biếng ăn, tích dịch ở bụng, mang nhợt nhạt. Bệnh thường xuất hiện khi môi trường xấu, da bị tổn thương[36].
Bảng 3.2. Các đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập từ cá chẽm bị bệnh nuôi trong ao đất tại Hải Phòng
Các đặc điểm sinh
hóa
Tên loài vi khuẩn
V.alginolyticus V.vulnificus Pseudomonas sp Aeromonas sorbia Nhuộm Gram - - - - OF +/+ +/+ +/- +/+ ONPG - + + - ADH - - + - LDC + + - - ODC + - - - CIT + + + + H2S - - - - URE - - - - TDA - - - + IND + + - - VP + - + - GEL + + + - GLU + + - - MAN + + - + INO - + - - SOR - - - - RHA - - - + SAC + - - + MEL + - - + AMY + + - - ARA + - - - Oxidase + + + + Catalase + + + +
Vibrio alginolyticus: Gram (-), hình que ngắn, di động, trên môi trường TCBS
khuẩn lạc có màu vàng, bờ không đều. Trên môi trường TSA, khuẩn lạc có màu trắng sữa, dễ mọc loang, oxidase (+), catalase (+), ONPG (-)....
Vibro vulnificus: Gram (-), hình que, trên môi trường TCBS có màu xanh,
oxidase (+), catalase (+), ONPG (+), phát triển tốt trong môi trường có nồng độ muối 3 và 7%, không phát triển trong môi trường có nồng độ muối 0% và 10%...
Pseudomonas sp.: Gram (-), hình que dài, di động. Trên môi trường NA khuẩn
lạc có dạng tròn, lồi, trắng sữa. Thử nghiệm catalase (+), oxidase (+),…
Aeromonas sorbia: Gram (-, ), hình roi ngắn. Trên môi trường NA khuẩn lạc
hình tròn, rìa đều, bóng, trong suốt, lồi thấp hoặc dẹp. Thử nghiệm catalase (+), oxidase (+),…
Hình 3.3: Hình ảnh vi khuẩn
V.alginolyticus khi nhuôm gram Hình 3.4: Khuẩn lạc V.alginolyticus trên môi trường TCBS màu vàng
Hình 3.5: Kết quả phản ứng sinh hóa của V. alginolyticus trên kít API 20E (A); Trên môi trường O/F (B)
* Tần suất bắt gặp các loài vi khuẩn trên cá chẽm có dấu hiệu bị bệnh lở loét
Trong tổng 120 mẫu thu được có 44 mẫu cá chẽm phân lập được loài vi khuẩn
Vibrio alginolyticus . Trong đó có 25/44 mẫu cá chẽm có dấu hiệu của bệnh lở loét và
phân lập được 03 loài vi khuẩn là Vibrio alginolyticus, V. vulnificus, Pseudomonas sp.
Vibrio alginolyticus có tần số bắt gặp cao nhất (100%) và cũng là loài có số lượng khuẩn lạc xuất hiện nhiều nhất khi cấy trên các môi trường NA và TCBS. Đồng thời cũng bắt gặp trên tất cả các cơ quan phân tích (gan, thận, vết loét). Ở gan phân lập được Pseudomonas sp, V. vulnificus phân lập được trên vết loét. Loài vi khuẩn còn lại là Aeromonas sorbia không bắt gặp trên cá có dấu hiệu bị bệnh lở loét.
Hình 3.6: Tần suất bắt gặp của các loài vi khuẩn trên cá chẽm bị bệnh lở loét
Chủng vi khuẩn V.alginolyticus xuất hiện ở tất cả các cơ quan phân tích, tần số bắt gặp Pseudomonas sp trên vết loét 16%, gan 8%; Vibrio vulnificus có tần số bắt gặp trên vết loét là 12 %, không bắt gặp ở gan và thận không bắt gặp ở thận.
Bệnh lở loét được ghi nhận đã xuất hiện và làm chết cá vào mùa hè năm 2008, 2009 ở một số cơ sở nuôi cá mú tại Sông Cầu, thuộc tỉnh Phú Yên và Cam Ranh thuộc tỉnh Khánh Hòa. Trong năm 2010 và đầu năm 2011, bệnh cũng xuất hiện nhiều ở các vùng nuôi cá mú trong ao và trong lồng nổi trên biển thuộc các tỉnh Phú Yên, Khánh
Hòa và Vũng Tàu. Bệnh xuất hiện nhiều vào mùa hè và nhất là vào lúc giao mùa gây tỷ lệ chết cao.
Theo PGS.TS Đỗ Thị Hòa, trường Đại học Nha Trang đã nghiên cứu Vibrio là tác nhân chính gây chết trên cá chẽm, tỉ lệ cao ở cá nuôi lồng (100%), cá nuôi ao gặp thấp hơn (58,2%). Một số loài vi khuẩn Vibrio spp. đã phân lập được từ nội tạng cá bệnh, trong đó Vibrio anguillarum đã gây bệnh trong điều kiện cảm nhiễm nhân tạo (60-80%). Theo Nguyễn Thanh Chương và Đồng Thanh Hà, vi khuẩn phân lập được trên mẫu bệnh cá chẽm tại xã Hải Dương, thị xã Hương Trà, tỉnh Thừa Thiên Huế bao gồm: Vibrio cholera, Flexibacter-like, Aeromonas allosacharophila.
3.2. Kết quả cảm nhiễm chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus phân lập từ cá chẽm bệnh lên cá chẽm khỏe chẽm bệnh lên cá chẽm khỏe
Từ kết quả phân lập và định danh vi khuẩn đề tài tiến hành cảm nhiễm nhân tạo chủng vi khuẩn có tần số bắt gặp cao nhất là Vibrio alginolyticus để khẳng định chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus phân lập được là tác nhân gây bệnh. Thực hiện thử nghiệm cảm nhiễm ngược trở lại vi khuẩn Vibrio alginolyticus với liều thử thách là
1x103, 1x104, 1x105, 1x106 CFU/g trọng lượng cơ thể cá. Qua hai lần thử nghiệm, kết quả thu được như sau:
Hình 3.8: Biểu đồ tỷ lệ chết của cá chẽm cảm nhiễm chủng vi khuẩn V.alginolyticus lần 2
Bảng 3.3. Kết quả cảm nhiễm vi khuẩn gây bệnh trên cá chẽm của 2 lần cảm nhiễm chủng vi khuẩn V.alginolyticus đã phân lập
Vi khuẩn cảm nhiễm Lần cảm nhiễm Nồng độ vi khuẩn (cfu/g) Thời gian phát bệnh và chết lần đầu tiên (giờ) Dấu hiệu bệnh lý Vibrio alginolyticus Lần 1
1x103 168 Vết tiêm tấy đỏ, mặt bụng xuất huyết và xuất hiện vết loét 1x104 144 Vết tiêm tấy đỏ, mặt bụng xuất
huyết và xuất hiện vết loét
1x105 24
Vết tiêm tấy đỏ, sau đó vết tiêm sưng phồng, da trở nên xám đen, mặt bụng xuất hiện vết loét; hậu môn sưng, xuất huyết
1x106 24
Vết tiêm tấy đỏ và sưng phồng lên, da trở nên đen xám. Đến ngày thứ 3 mặt bụng xuất huyết, xuất hiện vết loét, hậu môn sưng, xuất huyết, mắt cá lồi đục. Sau 120 giờ tiêm (5 ngày) thì cá chết 100%.
Đối chứng
Cá hoạt động bình thường trong suốt quá trình thí nghiệm
Lần 2
1x103 144 Vết tiêm sưng, mắt cá lồi đục, bụng xuất huyết
1x104 120
Da trở nên xám đen, mặt bụng xuất hiện vết loét; hậu môn sưng, xuất huyết
1x105 72 Hậu môn sưng, xuất huyết, mắt cá lồi đục.
1x106 48
Vết tiêm đỏ tấy, da trở nên xám đen, bụng xuất huyết và xuất hiện vết loét
Đối chứng
Cá hoạt động bình thường trong suốt quá trình thí nghiệm
Kết thúc hai đợt thí nghiệm thứ nhất cho thấy: Khi tiêm vi khuẩn vào cá khỏe, cá có các dấu hiệu giống như cá bị bệnh ở ngoài tự nhiên như cá hoạt động yếu, da trở nên xám đen, mặt bụng xuất huyết, cá xuất hiện vết loét, hậu môn sưng xuất huyết, mang mất nhớt, thối rữa, mắt cá lồi đục. Giải phẫu bên trong thấy xoang bụng chứa nhiều dịch; gan cá xuất huyết, hại tử; thận sưng, xuất huyết. Vi khuẩn phân lập lại được từ gan, thận cá chính là vi khuẩn V. alginolyticus – chủng vi khuẩn cảm nhiễm ban đầu
Qua 2 đợt thí nghiệm cảm nhiễm cùng một chủng vi khuẩn V. alginolyticus cho thấy, cá có các dấu hiệu giống nhau. Từ kết quả này có thể kết luận V. alginolyticus là tác nhân gây nên bệnh trên cá chẽm nuôi trong ao đất tại Hải Phòng với liều gây chết LD50 sau 10 ngày là 1×104 CFU/g. Tuy nhiên, trong lần thí nghiệm thứ 2 thì cá chết
chậm hơn điều này có thể là do ở lần thí nghiệm thứ 2 đề tài đã dùng cá có kích thước lớn hơn để tiêm cảm nhiễm, có thể cá có kích thước và trọng lượng lớn hơn nên sức đề kháng của cá có thể cao hơn so với các cá sử dụng để làm thí nghiệm cảm nhiễm lần đầu.
3.3. Kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus phân lập từ cá chẽm bị bệnh phân lập từ cá chẽm bị bệnh
Sau khi xác định V. alginolyticus là một trong những tác nhân chính gây bệnh
trên cá chẽm nuôi trong ao đất tại Hải Phòng, đề tài đã tiến hành thử nghiệm kháng sinh đồ với 11 loại kháng sinh là: Tetracycline (Te), ampicillin (Am), rifamycin (Rf), streptomycin (Sm), erythromycine (Er), doxyciline (Dx), neomycine (Ne), amoxicilline (Ax), trimethoprim (Bt), oxaciline (Ox), novobiocine (Nv) nhằm tìm ra kháng sinh phù hợp để điều trị bệnh cho cá. Theo thông tư số 08/VBHN-BNNVPTNT ngày 25 tháng 2 năm 2015 của bộ trưởng bộ NN & PTNT về danh mục hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng trong sản xuất kinh doanh thủy sản, những thuốc kháng sinh đã sử dụng làm kháng sinh đồ trên là những thuốc được phép sử dụng trong nuôi trồng thủy sản.
Kết quả thử kháng sinh đồ cho thấy có 01 loại nhạy cảm cao với V.alginolyticus là Tetracycline; 06 loại kháng sinh nhạy cảm ở mức trung bình là Rifamycin,
Erythromycine, Neomycine, Trimethoprim, Novobiocine, Doxyciline; 04 loại kháng sinh bị kháng là Ampicillin, Streptomycin, Amoxicilline, Oxaciline.
Bảng 3.4. Tính nhạy cảm của V.alginolyticus đối với các loại kháng sinh
Loại kháng sinh Đường kính vòng vô khuẩn đo được (mm) Kết luận
Tetracycline 21 Nhạy cảm
Ampicillin 0 Đề kháng
Rifamycin 16 Nhạy cảm vừa
Streptomycin 9 Nhạy cảm kém
Erythromycine 15 Nhạy cảm vừa
Doxyciline 20 Nhạy cảm vừa
Neomycine 12 Nhạy cảm vừa
Amoxicilline 0 Đề kháng
Trimethoprim 17 Nhạy cảm vừa
Oxaciline 0 Đề kháng
Novobiocine 13 Nhạy cảm vừa
Kết quả thử kháng sinh đồ cho thấy vi khuẩn V.alginolyticus có tính mẫn cảm cao nhất (đường kính vòng vô khuẩn 21mm) với thuốc kháng sinh Tetracyline 30μg, sau đó đến thuốc kháng sinh Doxyciline 30μg (đường kính vòng vô khuẩn 20 mm). Đối với kháng sinh Ampicillin 10 μg, Amoxicilline , Oxaciline; vi khuẩn có tính mẫn cảm trung bình, mẫn cảm kém với các thuốc kháng sinh Rifamycin 5μg, Streptomycin