Nguyên tắc của phương pháp này là dựa trên khả năng của các chất chống oxy hĩa trong việc khử phức Fe3+-TPTZ [2,4,6-tripydyl-s-triazine] màu tím thành
phức Fe2+-TPTZ màu xanh ở pH thấp. Khi đĩ, độ tăng cường độ màu xanh tỷ lệ với
hàm lượng chất chống oxy hĩa cĩ trong nguyên liệu. Mức độ tăng cường độ màu này được đo ở bước sĩng 593 nm trong sự so sánh với chất chuẩn là dung dịch
FeSO4 hoặc BHT (Butylated hydroxy toluene).
Khi cho phức Fe3+-TPTZ vào mơi trường chứa chất chống oxy hĩa, các chất
oxy hĩa sẽ nhường điện tử cho phức này và tạo thành Fe2+-TPTZ. Kết quả tính tốn
được biểu diễn bằng mmol Fe2+/g chất khơ. Do đĩ, khi kết quả tính tốn rất lớn thì
chúng ta cĩ thể suy đốn rằng trong mơi trường phản ứng đĩ số lượng các phân tử cĩ thể nhường điện tử là cao. Tuy nhiên, điều này khơng hồn tồn đúng vì một
phân tử chất chống oxy hĩa cĩ thể khử nhiều phức Fe3+-TPTZ cùng lúc. Đây là hạn
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Tỏi Phan Rang được mua ở chợ Vĩnh Hải, TP. Nha Trang, tỉnh Khánh Hịa.
Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm thí nghiệm thực hành trường Đại học Nha Trang. Thời gian nghiên cứu: từ ngày 16/03/2015 đến ngày 07/06/2015.
2.2. Vật liệu, hĩa chất nghiên cứu 2.2.1. Nguyên liệu tỏi 2.2.1. Nguyên liệu tỏi
Nguyên liệu tỏi sử dụng trong nghiên cứu là tỏi Phan Rang, được thu mua từ chợ Vĩnh Hải, vận chuyển về phịng thí nghiệm bằng dụng cụ chứa chuyên dụng. Tại phịng thí nghiệm, lựa chọn những củ đạt tiêu chuẩn (củ to, cịn nguyên vẹn, lớp vỏ dày, khơng bị dập và khơng bị sâu mọt) để tiến hành lên men.
Trong nghiên cứu này, vật liệu để tiến hành nghiên cứu là tỏi đen được lên
men từ Tỏi nguyên liệu (A. sativum) cĩ độ ẩm từ 60-70%.
2.2.2. Hĩa chất
Chì acetat (Pb(CH3COO)2), Đồng sunfat tinh thể (CuSO4.5H2O),
Kalinatritarat, Natri hydroxit tinh thể (NaOH), Sắt (III) sunfat tinh thể (Fe2(SO4)3), Acid sunfuric đậm đặc (H2SO4), Kali pemaganat (KMnO4), K3(Fe[CN]6), Dung dịch đệm phosphat, Acid tricloroacetic (TCA), Sắt clorua (FeCl3), Methanol
(CH3OH), Ethanol (C2H5OH), Nhơm clorua (AlCl3), Kalinatritartrate
(KNaC4H4O6.4H20), Cloroform, Kaliclorua (KCl); DPPH và Folin regent được mua
từ cơng ty Hĩa chất Simga (Hoa Kì).
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Quy trình lên men sản xuất tỏi đen
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình lên men sản xuất tỏi đen
Giải thích quy trình:
Tỏi nguyên liệu: Tỏi sử dụng trong lên men phải đáp ứng các tiêu chuẩn như: củ tỏi phải đồng đều, độ ẩm vừa phải, các tép tỏi khơng bị dập nát, củ tỏi phải được bao với nhiều lớp vỏ bên ngồi.
Xử lý: Tỏi nguyên liệu được xử lý nhằm loại bỏ rễ, cắt ngắn phần thân cho phù hợp với yêu cầu của cơng nghệ.
Làm sạch, để ráo: Tỏi sau khi xử lý được rửa sạch và để ráo trước khi lên men. Tỏi nguyên liệu
Xử lí
Làm sạch, để ráo
Lên men
Sấy khơ
Bao gĩi, bảo quản
Lên men: Tỏi được xếp vào các khay inox đưa vào tủ ổn nhiệt để tiến hành lên men. Đây là cơng đoạn quyết định đến chất lượng của sản phẩm.
Sấy khơ: Sau khi lên men, tỏi đen được sấy khơ đến độ ẩm đạt khoảng 30%.
Bao gĩi, bảo quản: Sau khi kết thúc quá trình lên men, tỏi đen được bao gĩi hút chân khơng trong bao bì PA và bảo quản lạnh.
2.3.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu sự biến đổi của một số thành phần hĩa lý và hoạt tính chống oxy hĩa của tỏi theo thời gian lên men.
Nguyên liệu tỏi
Xử lý
Lên men
Lấy mẫu phân tích
Xác định một số thành phần hĩa lý: - Hàm lượng nước - Hàm lượng tro - Hàm lượng acid tổng - Hàm lượng polyphenol tổng
Xác định hoạt tính chống oxy hĩa:
- Khả năng khử gốc tự do
DPPH.
- Tổng năng lực khử.
Điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm
Giải thích quy trình:
Nguyên liệu tỏi: Tỏi nguyên liệu (A. sativum) được thu mua từ chợ Vĩnh Hải, vận chuyển về phịng thí nghiệm bằng dụng cụ chứa chuyên dụng và được bảo quản ở nhiệt độ phịng.
Xử lý: Tỏi được tách ra khỏi chùm, sau đĩ lựa chọn những củ đạt tiêu chuẩn như củ tỏi phải đồng đều, các tép tỏi khơng bị dập, khơng bị sâu mọt, củ tỏi phải được bao bởi nhiều lớp vỏ bên ngồi…trước khi xếp vào khay inox cho vào tủ ổn nhiệt để tiến hành lên men.
Lên men: Tỏi được lên men ở các chế độ nhiệt độ và độ ẩm khác nhau trong thời gian 13 ngày. Trong thời gian 3 ngày đầu tiên của quá trình lên men, tỏi được
giữ ở nhiệt độ 75 °C và độ ẩm tương đối là 90%. Trong 4 ngày lên men tiếp theo,
tỏi được giữ ở nhiệt độ 65 °C và độ ẩm tương đối 80%. Trong thời gian 6 ngày lên
men cuối cùng, tỏi được duy trì ở nhiệt độ 60 °C và độ ẩm tương đối 70%.
Lấy mẫu phân tích: Trong thời gian lên men, mẫu tỏi được thu nhận ở các ngày 0, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 để tiến hành đánh giá sự biến đổi một số thành phần hĩa lý và hoạt tính chống oxy hĩa của tỏi. Mẫu tỏi mỗi lần lấy được đựng trong túi PA, hút chân khơng và bảo quản lạnh.
Xác định một số thành phần hĩa học và hoạt tính chống oxy hĩa:
Để tiến hành xác định một số thành phần hĩa học và hoạt tính chống oxy hĩa của tỏi trong thời gian lên men, trước hết phải chuẩn bị mẫu:
Khoảng 90 - 100 g (15 - 20 củ) tỏi nguyên liệu được thu nhận sau mỗi ngày lên men. Các mẫu tỏi được bĩc vỏ, đồng hĩa và bảo quản trong các ống Falcon 50 ml ở nhiệt độ 4 ºC trước khi tiến hành phân tích.
2.3.3. Phương pháp phân tích
2.3.3.1. Phương pháp xác định hàm lượng nước (Phụ lục 1)
Hàm lượng nước của tỏi được xác định bằng cách sấy mẫu ở nhiệt độ 103 ± 1 ºC trong thời gian 4 giờ theo phương pháp ISO 6496:1999 [33].
2.3.3.2. Phương pháp xác định hàm lượng tro (Phụ lục 2)
Hàm lượng tro tồn phần của tỏi được xác định bằng cách nung mẫu ở nhiệt
độ 550 – 600 °C theo TCVN 7038:2002 nhằm mục đích đốt cháy hết các hợp chất
hữu cơ. Hàm lượng tro tồn phần được tính tốn dựa vào phần khối lượng cịn lại sau khi nung và khối lượng của mẫu trước khi nung [14].
2.3.3.3. Phương pháp xác định hàm lượng acid tổng (Phụ lục 3)
Hàm lượng acid tổng trong tỏi được xác định theo phương pháp chuẩn độ của AOAC:1990 [22].
2.3.3.4. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số (Phụ lục 4) Chuẩn bị mẫu: Chuẩn bị mẫu:
Cân chính xác 1 g mẫu cho vào bình tam giác 100 ml, sử dụng cân phân tích
chính xác đến 10-4 g. Tiếp theo cho 25 ml nước cất vào. Sau đĩ các mẫu được chiết
ở nhiệt độ 80 ºC, trong thời gian khoảng 60 phút kết hợp với sử dụng sĩng siêu âm. Kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp được lọc qua giấy lọc(GP/T1914-2007, ø = 11 cm). Dịch lọc thu được sử dụng để xác định hàm lượng polyphenol tổng số, khả năng bắt gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử.
Hàm lượng polyphenol tổng số được xác định bằng phương pháp của Singleton và cộng sự (1999) với một vài hiệu chỉnh nhỏ [47].
2.3.3.5. Phương pháp xác định khả năng khử gốc tự do DPPH (Phụ lục 5)
Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH là phương pháp được sử dụng rộng rãi để đánh giá khả năng khử gốc tự do của các mẫu khác nhau.
Khả năng khử gốc tự do được xác định được xác định bằng phương pháp của Fu và cộng sự (2002) với một vài sự hiệu chỉnh nhỏ [30].
2.3.3.6. Phương pháp xác định tổng năng lực khử (Phụ lục 6)
Năng lực khử được xác định theo phương pháp của Oyaizu (1986) với một vài sự hiệu chỉnh nhỏ [44].
2.3.4. Phương pháp xử lí số liệu
Các kết quả thí nghiệm được xác định từ trung bình cộng của 2 lần thí nghiệm độc lập. Đồ thị được vẽ bằng phần mềm MS Excel 2010 (Microsoft Corporation, US).
Các giá trị trung bình được so sánh dựa vào phân tích AVOVA và kiểm định Duncan (Duncan’s Multiple-Comparison Test) trên phần mềm SPSS 20.0 (SPSS Inc., Chicago, Il). Khác biệt cĩ ý nghĩa tại giá trị p < 0,05.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Sự thay đổi màu sắc của tỏi theo thời gian lên men
Ngày 0 Ngày 1
Ngày 3 Ngày 5
Ngày 7 Ngày 9
Ngày 11 Ngày 13
Màu sắc là một trong những tính chất vật lý quan trọng nhất của sản phẩm thực phẩm, ảnh hưởng đến sự đánh giá sản phẩm của người tiêu dùng. Hình 3.1 thể hiện sự thay đổi màu sắc của tỏi sau hơn 10 ngày lên men. Sự thay đổi màu sắc này là do trong quá trình lên men ở điều kiện nhiệt độ thích hợp cho phản ứng Maillard xảy ra, đây là phản ứng biến nâu phi enzym. Trong suốt quá trình lên men, các sản phẩm của phản ứng Maillard tạo ra gĩp phần tạo màu cho sản phẩm tỏi đen.
Theo Bae và cộng sự (2013), tỏi được lên men trong 45 ngày ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau là 40, 55, 70 và 85 ºC (với độ ẩm tương đối 70%), cường độ màu nâu của tỏi tăng liên tục trong quá trình lên men. Tuy nhiên, tỏi lên men ở điều kiện nhiệt độ 40-70 ºC cĩ cường độ biến nâu ít sâu sắc hơn so với tỏi lên men ở 85ºC, cường độ biến nâu của tỏi lên men ở ngày thứ 45 trong điều kiện nhiệt độ 40 và 85 ºC lần lượt là 0,69 và 2,05. Điều này cho thấy, ở nhiệt độ thích hợp cho phản ứng Maillard xảy ra sẽ làm cường độ biến nâu của tỏi thay đổi nhanh hơn [24].
Theo kết quả thu được kết hợp với các nghiên cứu trước đĩ cho thấy cường độ biến nâu của tỏi biến đổi theo từng ngày lên men.
3.2. Sự thay đổi hàm lượng nước của tỏi theo thời gian lên men
Nước là thành phần hĩa học chiếm khoảng 60-70% trong thành phần của củ tỏi, do nước chiếm một lượng lớn nên duy trì độ trương của tế bào làm cho củ tỏi cĩ hình dáng nhất định. Bên cạnh đĩ, nước cịn là nguyên liệu tham gia vào một số quá trình trao đổi chất của tỏi. Nước cĩ sức căng bề mặt lớn nên cĩ lợi cho việc hấp thụ và vận chuyển vật chất.
Sự biến đổi hàm lượng nước của tỏi theo thời gian lên men được thể hiện ở Hình 3.2.
Hình 3.2. Sự thay đổi hàm lượng nước của tỏi theo thời gian lên men
Kết quả nghiên cứu cho thấy, hàm lượng nước của tỏi giảm dần theo thời gian lên men. Hàm lượng nước của tỏi nguyên liệu là 67,77%, trong khi hàm lượng này của tỏi ở ngày lên men thứ 5 và 13 lần lượt là 59,56 và 53,98%. Trong đĩ, hàm lượng nước giảm mạnh trong 3 ngày đầu lên men , thay đổi khơng đáng kể ở 4 ngày
tiếp theo và tiếp tục giảm mạnh ở 6 ngày cuối cùng.
Sự thay đổi này là do trong quá trình lên men cĩ sự chênh lệch nhiệt và ẩm giữa tỏi và mơi trường khơng khí xung quanh do đĩ đã xảy ra quá trình trao đổi nhiệt và trao đổi ẩm trong thiết bị lên men, nhiệt độ cao đã thúc đẩy quá trình dịch chuyển ẩm từ trong tỏi ra bề mặt và thốt ra mơi trường ngồi. Ở 3 ngày đầu lên men, dưới tác dụng của nhiệt độ và độ ẩm cao (75 ºC, 90%), nước khuếch tán và thốt ra ngồi nhanh do đĩ hàm lượng nước trong tỏi giảm mạnh; ở 4 ngày tiếp theo, nhiệt độ giảm xuống cịn 65 ºC làm cho khả năng thốt hơi nước của tỏi chậm lại, do đĩ hàm lượng nước trong tỏi thay đổi khơng nhiều; tiếp tục giảm nhiệt độ và độ ẩm ở 6 ngày kế tiếp, với độ ẩm tương đối thấp và thời gian kéo dài làm cho hàm lượng nước của tỏi tiếp tục giảm nhanh. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với một
số nghiên cứu khác. Bae và cộng sự (2013) nghiên cứu về sự thay đổi của S-allyl cysteine và các tính chất hĩa lý của tỏi đen trong quá trình lên men, các mẫu tỏi được lên men trong thời gian 45 ngày ở các nhiệt độ khác nhau (40,55,70 và 85 ºC) trong cùng độ ẩm khơng khí tương đối 70%, hàm lượng nước ban đầu của tỏi tươi nguyên liệu là 66,1%, giá trị này ở ngày lên men thứ 45 giảm cịn 53,4% (ở 40 ºC) và 45,3% (ở 85 ºC). Kết quả này cho thấy, hàm lượng nước của tỏi phụ thuộc vào nhiệt độ lên men, nhiệt độ lên men càng cao thì hàm lượng nước cịn lại của tỏi càng thấp [24]. Theo nghiên cứu khác của Choi và cộng sự (2014), mẫu tỏi đươc lên men ở điều kiện nhiệt độ 70 ºC và độ ẩm tương đối 90%, hàm lượng nước ban đầu của tỏi tươi là 64,21%, trong khi hàm lượng này của tỏi trong ngày lên men thứ 14 và 35 lần lượt là 31,77 và 29,88% [28].
Như vậy, dựa vào kết quả nghiên cứu và kết quả của các nghiên cứu trước
đĩ cho thấy: hàm lượng nước của tỏi giảm dần theo thời gian lên men. Tuy nhiên, sự biến đổi hàm lượng nước của tỏi phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ và độ ẩm của quá trình lên men.
3.3. Sự thay đổi hàm lượng tro của tỏi theo thời gian lên men
Tro là thành phần cịn lại của thực phẩm sau khi nung cháy hết các chất hữu cơ. Tro thực chất chỉ gồm các loại muối khống cĩ trong thực phẩm.
Sự thay đổi hàm lượng tro của tỏi trong thời gian lên men được thể hiện ở Hình 3.3.
Hình 3.3. Sự thay đổi hàm lượng tro của tỏi theo thời gian lên men
Theo kết quả thí nghiệm thu được cho thấy hàm lượng tro của tỏi thay đổi khơng đáng kể theo thời gian lên men, điều này do hàm lượng các chất khống của tỏi ít bị biến đổi trong quá trình lên men.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, hàm lượng tro trong tỏi lên men khơng cĩ sự
khác biệt nhiều so với tỏi nguyên liệu.
3.4. Sự thay đổi hàm lượng acid tổng của tỏi theo thời gian lên men
Hình 3.4 Sự thay đổi hàm lượng acid tổng của tỏi theo thời gian lên men
Theo kết quả nghiên cứu, hàm lượng acid tổng trong tỏi nguyên liệu ban đầu là 0,41 mg/kg, trong khi đĩ hàm lượng này trong tỏi ở ngày lên men thứ 7 và 13 lần lượt là 2,57 và 3,04 mg/kg. Như vậy, sau 13 ngày lên men, hàm lượng acid tổng của tỏi tăng gấp 7 lần.
Hàm lượng acid tổng của tỏi tăng theo thời gian lên men là do trong quá trình lên men cĩ sự hình thành các acid cacboxyl (được tạo ra bởi quá trình oxy hĩa nhĩm aldehyt trong aldohexo, các hợp chất cĩ tính acid, các acid amin cơ bản giảm do liên kết với đường).
Theo Choi và cộng sự (2014), hàm lượng acid tổng của tỏi tăng trong 35 ngày lên men ở điều kiện 70 ºC và độ ẩm 90% [28].
Dựa vào kết quả thu được và kết quả các nghiên cứu trước đĩ cĩ thể kết
3.5. Sự thay đổi hàm lượng polyphenol tổng số của tỏi theo thời gian lên men
Polyphenol là hợp chất chống oxy hĩa phổ biến ở các lồi thực vật với hơn 8000 hợp chất đã được tìm thấy với cấu trúc từ đơn giản là acid phenol đến cấu trúc phức tạp là tannin . Theo nhiều nghiên cứu, polyphenol đã được chứng minh là hợp chất chống oxy hĩa chính của thực vật. Bên cạnh đĩ, polyphenol cịn cĩ tác dụng chống ung thư thơng qua một loạt các cơ chế, phát huy tác dụng cĩ lợi cho hệ thống mạch máu thơng qua một cảm ứng bảo vệ của chất chống oxy hĩa,…Hàm lượng phenolic từ thực vật càng cao thì hoạt tính chống oxy hĩa càng mạnh (Theo Marja và cộng sự, 1999) [40]. Sự thay đổi hàm lượng polyphenol tổng số của tỏi trong quá trình lên men được thể hiện ở Hình 3.5.
Hình 3.5. Sự thay đổi hàm lượng polyphenol tổng số theo thời gian lên men
Hàm lượng polyphenol tổng số tăng theo thời gian lên men. Hàm lượng polphenol tổng số trong tỏi nguyên liệu ban đầu là 11,89 mg GAE/g chất khơ, trong