1.4.1. Nghiên cứu ngồi nước
Hiện nay, trên thế giới tỏi đen đang được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu, đặc biệt là các nước Châu Á bởi các hoạt tính y dược của nĩ, trong đĩ cĩ thể kể đến các hoạt chất chống oxy hĩa, hoạt chất kháng khuẩn và hoạt chất chống ung thư. Tỏi tươi cĩ rất nhiều cơng dụng, tuy nhiên cĩ nhược điểm là mùi khĩ chịu; ngồi ra, trong một số trường hợp việc ăn tỏi tươi cịn làm rối loạn chức
năng dạ dày, do đĩ, để khắc phục nhược điểm này, các nhà khoa học Nhật Bản, Hàn Quốc đã tiến hành lên men tỏi tươi thành tỏi đen. Khi tỏi trải qua quá trình lên men, các quá trình thay đổi hĩa lý xảy ra như thay đổi về màu sắc, thành phần hĩa học và các hoạt tính y dược. Đặc biệt, xử lý nhiệt dẫn đến phản ứng hĩa nâu phi enzym như các phản ứng Maillard, caramen hĩa và quá trình oxy hĩa các hợp chất polyphenol.
Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng, tỏi đen chứa nhiều hoạt chất sinh học và cĩ hoạt tính y dược cao hơn so với tỏi tươi như tác dụng chống oxy hĩa, phịng ngừa hội chứng chuyển hĩa và nhiễm độc gan do rượu, phịng chống sự phát triển của tế bào ung thư (Ide và Lau, 1996; Bae và cộng sự, 2014) [24], [32]. Kết quả của nhiều nghiên cứu cho thấy sự tăng hoạt chất S-allyl cysteine (SAC) là sự thay đổi quan trọng nhất trong quá trình lên men tỏi đen. Hàm lượng SAC trong tỏi tươi khoảng 20-30 µg/g, sau khi lên men hàm lượng này của tỏi đen cao gấp 5-6 lần so với tỏi tươi (Bae và cộng sự, 2014; Wang và cộng sự, 2010) [24], [50].Theo nghiên cứu của Purev và cộng sự (2012) đã chỉ ra rằng, hoạt chất SAC trong tỏi đen cĩ tác
dụng làm tăng khả năng miễn dịch cho cơ thể [45]. Ngồi ra, trong tỏi đen cịn chứa
nhiều hoạt chất như polyphenol, hợp chất sulfur hữu cơ,…cĩ tác dụng ngăn ngừa gốc tự do, chống lão hĩa.
Sản phẩm tỏi đen được tiêu thụ phổ biến trên thị trường Nhật Bản, Hàn Quốc, Mỹ, Trung Quốc…với nhiều dạng sản phẩm khác nhau như: viên nang, cao tỏi đen, nước giải khát,…
1.4.2. Nghiên cứu trong nước
Tỏi đen được sử dụng khá phổ biến khơng chỉ làm thức ăn, mà cịn được nghiên cứu sử dụng trong ngành cơng nghệ dược phẩm do cĩ hoạt tính y dược cao. Tuy nhiên, đây là sản phẩm tương đối mới trên thị trường Việt Nam. Ở Việt Nam, người tiêu dùng sử dụng tỏi đen với một số mục đích như: bồi bồ sức khỏe, tăng cường thể trạng sau ốm; phịng chống xơ vữa động mạch, phịng và hỗ trợ điều trị tai biến mạch máu não; bảo vệ gan; phịng ngừa biến chứng bệnh tiểu đường; chống oxy hĩa, phịng ngừa lão hĩa,…Mặc dù tỏi đen cĩ nhiều cơng dụng rất tốt cho sức
khỏe con người, nhưng mới chỉ cĩ một cơng trình nghiên cứu của các nhà khoa học thuộc Học viện Quân y trong việc nghiên cứu tỏi đen được lên men trên đối tượng tỏi Lý Sơn. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu vẫn chưa được các nhà khoa học cơng bố ở các tạp chí khoa học. Vì vậy, việc nghiên cứu các chỉ tiêu hĩa lý và hoạt tính chống oxy hĩa của tỏi đen là hết sức cần thiết, nhằm cung cấp cơ sở khoa học về hoạt tính y dược của tỏi đen, gĩp phần tạo niềm tin đối với tỏi đen của người tiêu dùng, từ đĩ nâng cao giá trị của tỏi đen.
1.5. Khái quát về gốc tự do và chất chống oxy hĩa 1.5.1. Gốc tự do 1.5.1. Gốc tự do
Các gốc tự do hay nĩi chính xác hơn là các chất hoạt động chứa oxy và nito (Reactive Oxygen Species-ROS và Reactive Nitrogen Species-RNS) là các dẫn xuất dạng khử của oxy và nito phân tử, chúng được chia thành 2 nhĩm lớn là các gốc tự do và các dẫn xuất khơng phải gốc tự do. Các gốc tự do là các nguyên tử hoặc phân tử cĩ một hoặc nhiều điện tử độc thân. Các dẫn xuất khơng phải gốc tự do như oxy đơn, hydroperoxide, nitroperoxide là tiền chất của các gốc tự do. Các ROS VÀ RNS được tạo ra một cách tất yếu trong quá trình trao đổi chất và tùy thuộc vào nồng độ mà chúng cĩ tác dụng tốt hay xấu đến cơ thể. Sự phá hủy các đại phân tử sinh học bởi ROS và RNS là nguyên nhân của rất nhiều bệnh nguy hiểm. Để bảo vệ cơ thể khỏi tác động xấu của ROS và RNS, tế bào được trang bị một hệ thống bảo vệ bao gồm các chất chống oxy hĩa [4].
1.5.2. Chất chống oxy hĩa
Chất chống oxy hĩa là các hợp chất cĩ khả năng làm chậm lại, ngăn cản hoặc đảo ngược các quá trình oxy hĩa các hợp chất cĩ trong cơ thể [4]. Dựa trên nguyên tắc hoạt động, các chất chống oxy hĩa được phân thành 2 loại: các chất chống oxy hĩa bậc I, các chất chống oxy hĩa bậc II.
1.5.2.1. Cơ chế hoạt động của các chất chống oxy hĩa
Các chất chống oxy hĩa bậc 1: Vơ hoạt các gốc tự do Khử các gốc tự do:
L* + A LH + A*
LOO* + AH LOOH + A*
LO* + AH LOH + A*
Tạo hợp chất với các gốc tự do:
A* + LOO* LOOA
A* + LO* LOA
Các chất chống oxy hĩa bậc II: ngăn chặn sự tạo ra các gốc tự do (hấp thụ tia cực tím, tạo phức với các kim loại kích hoạt sự tạo gốc tự do như Cu, Fe; vơ hoạt oxy đơn (Theo Singh and Rajini, 2004; Rolland, 2004) [48].
Superoxid dismutase
Superoxid dismutase (SOD) là enzyme chống oxy hĩa cĩ chứa kim loại thuộc loại oxidoreductase, nĩ xúc tác cho phản ứng chuyển hĩa superoxid O2 và H2O2:
2O•2 + 2H+ →SOD H
2O2 + O2
Cơ chế phản ứng SOD: SOD là metalloenzym chống oxy hĩa trong tế bào, xúc tác phản ứng dị ly oxy hĩa khử, phân hủy gốc superoxid. Quá trình trao đổi điện tử thực chất xảy ra tại trung tâm hoạt động ion kim loại xảy (Me) theo cơ chế phản ứng oxy hĩa khử gồm 2 bước:
Me3+ + • 2 O Me2+ + O2 Me2+ + • 2 O + 2H+ Me3+ + H2O2
Đầu tiên Me3+ bị khử bằng cách nhận một điện tử của gốc •
2
O và trở thành
dạng oxy hĩa Me2+, cịn •
2
O chuyển thành O2. Khi đĩ Me2+ tiếp tục tương tác với
một gốc •
2
O và nhường điện tử cho nĩ, với sự cĩ mặt của H+ chúng kết hợp với nhau để tạo thành H2O2. Qúa trình này tiếp tục lặp đi, lặp lại tạo nên một chu trình phản ứng khép kín. Chu trình bán hủy của SOD từ vài phút đến vài giờ, nĩ phụ thuộc vào nhĩm SOD khác nhau. SOD khơng qua được màng tế bào nên chỉ cĩ tác dụng cải thiện khả năng chống oxy hĩa nội bào.
Catalase (CAT)
Catalase là enzym xúc tác phản ứng phân hủy H2O2 và chỉ hoạt động khi H2O2 ở nồng độ cao (lớn hơn 10-8 mmol/L), catalase khơng phân hủy được peroxide hữu cơ và H2O2 ở nồng độ thấp vì chúng chỉ được hoạt hĩa khi H2O2 ở nồng độ cao.
H2O2Catalase→ H2O + ½ O2
Catalase cĩ mặt trong hầu hết các tế bào và các mơ động vật nhưng hoạt tính mạnh nhất là ở gan và thận, ít nhất là ở mơ, catalase cĩ chủ yếu trong các ty thể và peroxisome.
Peroxidase
Peroxidase là một nhĩm enzym xúc tác các phản ứng oxy hĩa khử, thuộc lớp oxidoreductase, xúc tác cho phản ứng sau.
AH2 + H2O2peroxidase→ A + 2H2O
Những gốc •
2
O được sinh ra từ O2 trong chuỗi vận chuyển điện tử sẽ bị SOD
phân hủy, nhưng lại tạo ra nhiểu H2O2. Vì vậy việc loại bỏ H2O2 là rất cần thiết,
đảm bảo hoạt động nội bào diễn ra bình thường. Peroxidase sử dụng H2O2 như là
một chất nhận điện tử xúc tác cho nhiều phản ứng oxy hĩa khử khác nhau, khi đĩ H2O2 bị khử thành H2O.
Hầu hết các peroxidase cĩ dùng cơ chế xúc tác phản ứng phân giải H2O2 và
được thực hiện theo các bước sau: - Tạo thành phức I hoạt động:
Enzym + H2O2 Complex I
- Chuyển hĩa phức hợp I thành phức hợp II hoạt động: Complex I + AH2 Complex II + •AH - Tái tạo enzym bằng quá trình khử phức hợp II:
Complex II + AH2 Enzym + •AH + 2 H2O
- Tạo thành sản phẩm:
Peroxidase cĩ coenzym là nhĩm heme b. Heme b là phức hợp tạo bởi phân tử protoporphyrin IX và một ion Fe2+ hoặc Fe3+ ở trung tâm. Một số peroxidae cịn mang gốc amino acid chứa vịng thơm nằm song song với mặt phẳng imidazol và chúng tương tác với nhau bằng lực Vander Waals.
Glutathione peroxidae (GPx)
GPx là eym xúc tác cho phản ứng loại bỏ các peroxid, hoạt động ở các mơ và hồng cầu khi nồng độ H2O2 thấp.
GPx
ROOH + 2GSH GSSG + ROH + H2O
Enzym này chủ yếu tồn tại bên trong ty thể và bào tương của tế bào, ở dịch ngoại bào rất thấp.
GPx cĩ hai loại: khơng phụ thuộc selen chiếm 20% xúc tác sự khử các hydroperoxid hữu cơ khi cĩ mặt glutathion nhưng khơng cĩ tác dụng trên H2O2; GPx phụ thuộc selen chiếm 80% xúc tác loại bỏ H2O2.
Glutathione cĩ bản chất là một tripeptide (L- γ-glutamyl cysteince), chính nhờ sự liên kết γ-peptide giữa glutamic acid và cysteine đĩ mà glutathione được bảo vệ, tránh khởi sự phân hủy bởi amino peptidase. Glutathione tồn tại ở 2 dạng; dạng khử (thiol GSH) và oxy hĩa (disulfide GS-SG). Cơ chế phản ứng của glutathione tham gia vào quá trình phân giải hợp chất peroxide như sau:
Hệ thống glutathion peroxidase gồm: glutathion peroxidase, glutathion reductase, glucose-6-phosphat dehidrogenase. Hoạt độ của GPx và catalase phụ
thuộc vào nồng độ H2O2, khi nồng độ H2O2 cao ức chế GPx và hoạt hĩa catalase
hoạt động và ngược lại khi nồng độ H2O2 thấp chỉ cĩ GPx hoạt động và catalase
1.5.2.2. Một số chất chống oxy hĩa Vitamin C Vitamin C
Vitamin C hay acid ascorbic là chất cĩ khả năng vơ hoạt các gốc tự do rất tốt do nĩ cĩ thể chuyển cho các gốc tự do hai nguyên tử hydro của nĩ và khi đĩ nĩ trở thành dehydroascorbic.
Ngồi khả năng vơ hoạt trực tiếp các gốc tự do, vitamin C cịn cĩ khả năng hoạt động hiệp lực với các chất chống oxy hĩa khác trong cơ thể như vitamin E, carotenoid và flavonoid. Khi cĩ sự tiếp xúc giữa vitamin E và gốc tự do peroxide của acid béo, vitamin E chuyển điện tử của nĩ cho gốc tự do nhưng đồng thời nĩ trở thành gốc tự do tocopheryl (vitamin E ở dạng oxy hĩa). Vitamin C tiến hành khử gốc tocopheryl thành vitamin E nguyên dạng, sẵn sàng vơ hoạt các gốc tự do peroxide mới, các carotenoid và các flavonoid khi vơ hoạt các gốc tự do cũng được hồn nguyên với cơ chế tương tự bởi vitamin C, điều này gĩp phần hạn chế sự tự kích hoạt oxy hĩa (pro-oxydante) của các gốc vitamin E và flavonoid [4].
Vitamin E
Vitamin E tồn tại ở tám dạng trong tự nhiên: 4 dạng tocopherol và 4 dạng tocotrienol. Cả 8 dạng này đều chứa một vịng thơm và một chuỗi mạch thẳng 16 cacbon. Các hợp chất tocotrienol khác với các tocopherol là cĩ thêm ba nối đơi ở chuỗi mạch C thẳng. Nhĩm hydroxyl gắn với vịng thơm quyết định khả năng chống oxy hĩa của vitamin E trong khi mạch cacbon đảm bảo khả năng hịa tan trong chất béo.
Tính chất hịa tan trong chất béo của vitamin E giúp chúng cĩ khả năng thâm nhập sâu vào các màng sinh học vốn chứa nhiều acid béo khơng no và ngăn cản chuỗi phản ứng oxy hĩa lipid. Các vitamin E cĩ khả năng ngăn chặn phản ứng của các gốc tự do bằng cách nhường một nguyên tử hydro của nĩ cho gốc tự do peroxide.
Tocopherol-OH + LOO Tocopherol-O+ LOOH
Carotenoid
Carotenoid là những hợp chất màu hữu cơ cĩ trong thực vật và một số sinh vật cĩ khả năng quang hợp. Chúng đem lại màu vàng đến đỏ cho thực vật đồng thời tham gia quá trình quang hợp với vai trị là sắc tố phụ. Các carotenoid thường cĩ một mạch cacbon dài (35-40 C) mang nhiều nối đơi, kết thúc bởi một cấu trúc vịng hoặc khơng.
Cơ chế hoạt động chống oxy hĩa của các carotenoid:
- Vơ hoạt oxy đơn
- Vơ hoạt các gốc tự do
Oxy đơn là sản phẩm của quá trình oxy hĩa sinh học và là một cấu tử cĩ mặt trong khơng khí. Trong số các chất chống oxy hĩa tự nhiên, các carotenoid cĩ khả năng vơ hoạt oxy đơn mạnh nhất bởi một cơ chế vật lý. Năng lượng dư của oxy đơn được chuyển giao cho carotenoid, oxy trở về trạng thái bình thường của nĩ trong khi carotenoid được chuyển lên trạng thí kích thích. Các carotenoid này sau đĩ quay trở lại trạng thái bình thường của nĩ bằng cách phát ra mơi trường năng lượng dư thừa mà nĩ nhận được từ oxy đơn. Khả năng vơ hoạt oxy đơn của carotenid phụ thuộc vào số liên kết đơi cĩ trong mạch cacbon của nĩ. Mỗi phân tử carotenoid cĩ khả năng vơ hoạt 1000 phân tử oxy đơn trước khi tham gia vào các phản ứng hĩa học và bị biến đổi thành các hợp chất khác.
Ngồi khả năng vơ hoạt oxy đơn, các carotenoid cịn vơ hoạt các gốc tự do bằng cách kết hợp với các gốc này theo một trong các cơ chế sau: [4]
- Chuyển điện tử: Car + ROO Car+ + ROO- - Chuyển hydro: Car + ROO Car + ROOH - Cộng hợp: Car + ROO ROOCa
Polyphenol
Các hợp chất phenol
Phenol là những hợp chất thơm cĩ nhĩm hydroxyl đính trực tiếp với nhân benzen. Phân tử cĩ nhiều nhĩm hydroxyl đính trưc tiếp vào vịng benzen gọi là polyhyroxylphenol (monomer), nhiều monomer gắn với nhau gọi là polyphenol.
Tùy theo cấu trúc mạch cacbon mà các hợp chất phenol được phân thành phenol đơn giản (C6), axit phenolic, flavonoid (C6-C3-C6), stilbene (C6-C2-C6) và ligbene (C6-C2)n [4].
Cies’lik và cộng sự (2004) đã nghiên cứu hàm lượng của polyphenol trong dịch chiết của một số loại trái cây và rau (Bảng 1.4).
Bảng 1.4. Hàm lượng polyphenol của một số loại trái cây và rau [29]
Trái cây Hàm lượng polyphenol/Khối lượng khơ (mg/100g) Rau quả Hàm lượng polyphenol/Khối lượng khơ (mg/100g) Nho hồng 683 Cà chua 1490 Mận 1599 Bắp cải 1620 Cam 1461 Hành tây 1339 Kiwi 2169 Cà rốt 1485
Táo 964 Bơng cải xanh 1924
(Nguồn: Theo Cies’lik và cộng sự, 2004)
Vai trị của polyphenol
Đối với thực vật: Các hợp chất phenol cĩ khả năng bảo vệ thực vật trước tia cực tím, chống lại sự oxy hĩa; bảo vệ thực vật trước sự tấn cơng của vi sinh vật gây hại; là vật liệu gĩp phần cho độ bền chức của thực vật và sự thấm của thành tế bào đối với nước và khí.
Đối với sản phẩm thực phẩm: Các hợp chất phenol là những chất hoạt động giữ vai trị chủ đạo quyết định đến hương vị, màu sắc của các sản phẩm thực phẩm. Chúng tham gia vào các quá trình tạo ra các cấu tử thơm mới, tạo ra mùi thơm đặc biệt cho sản phẩm. Ngồi ra, polyphenol là chất bảo quản tự nhiên khơng gây độc hại cho sản phẩm thực phẩm (Theo Lê Ngọc Tú, 2003) [17].
Đối với sức khỏe con người: Các hợp chất phenol cĩ khả năng chống oxy hĩa mạnh. Bên cạnh đĩ, polyphenol cĩ tác dụng chống ung thư thơng qua một loạt các cơ chế, bao gồm loại bỏ các tác nhân gây ung thư [49], kìm hãm sự phát tín hiệu của tế bào ung thư và chu trình phát triển tế bào, thúc đẩy quá trình apoptosit và
kìm hãm các hoạt động enzym. Theo nhiều nghiên cứu cho rằng polyphenol phát huy tác dụng cĩ lợi cho hệ thống mạch máu thơng qua một cảm ứng bảo vệ của chất chống oxy hĩa, do hạ huyết áp, bằng cách cải thiện chức năng nội mơ, bằng cách ức chế sự kết tụ tiểu cầu và giảm mật độ oxy hĩa lipoprotein và giảm những phản ứng viêm.
Ngồi ra, polyphenol cịn được bổ sung vào các sản phẩm như kem đánh răng, sữa tắm,…
Cơ chế chống oxy hĩa của các hợp chất phenol:
- Khử và vơ hoạt các gốc tự do nhờ thế oxy hĩa khử thấp.
- Tạo phức với các ion Fe2+ và Cu+.
- Kìm hãm hoạt động của các enzym cĩ khả năng tạo gốc tự do như
xanthine oxydase.
Các hợp chất flavonoid (Fl-OH) nhờ thế oxy hĩa khử thấp cĩ thể khử các gốc tự do như peroxyl, alkoxyle, hydroxyle bằng cách nhường nguyên tử hydro.