- Kiểm tra trên kính hiển vi Tiêm động vật thí nghiệm:
2. Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp:
- Kỹ thuật này không dùng kháng thể đặc hiệu nhuộm màu huỳnh quang, mà dùng kháng thể kháng gamma globulin của loài vật dùng để chế kháng thể đặc hiệu đem nhuộm màu huỳnh quang. Như vậy kháng thể đặc hiệu có 2 chức năng, chức năng là kháng thể đối với kháng nguyên cần chẩn đoán và chức năng là kháng nguyên đối với kháng thể gamma globulin nhuộm màu huỳnh quang. Như vậy chỉ cần nhuộm màu kháng thể kháng gamma globulin có thể chẩn đoán được nhiều bệnh truyền nhiễm.
- Chuẩn bị kháng nguyên chẩn đoán: giống như phần chuẩn bị trong phản ứng trực tiếp.
- Chuẩn bị kháng thể kháng gamma globulin: dùng gamma globulin của thỏ tiêm cho gà trống, sau 2-3 tuần lễ trong máu của gà có nhiều kháng thể chống gamma globulin của thỏ, lấy máu gà chắt lấy huyết thanh, rồi tách phần gamma globulin, sẽ thu được kháng thể kháng
gamma globulin của thỏ. Kháng thể này chắc chắn sẽ kết hợp đặc hiệu với gamma globulin của thỏ, đem nhuộm màu kháng thể này.
- Tiến hành phản ứng:
Sau khi đã cố định kháng nguyên trên tiêu bản, nhỏ 1-2 giọt kháng thể đặc hiệu, nếu kháng thể và kháng nguyên tương ứng, chúng sẽ kết hợp chặt chẽ với nhau, nhưng không phát sáng khi xem kính vì kháng thể đặc hiệu không được nhuộm màu.
Nhỏ tiếp 1-2 giọt kháng thể kháng gamma globulin đã nhuộm màu lên tiêu bản để tác động một thời gian rồi rửa nước, để khô, quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang sẽ thấy phát sáng vì có sự kết hợp 2 tầng.
o Tầng 1: giữa kháng thể và kháng nguyên đặc hiệu,
o Tầng 2: giữa kháng thể đặc hiệu với kháng gamma globulin, đó là phản ứng dương tính.
Kết luận trong bệnh phẩm có chứa virus dại.
Trong trường hợp kháng nguyên nghi không tương ứng với kháng thể đặc hiệu của bệnh dại thì sẽ không có sự kết hợp ở tầng 1, do đó khi nhỏ kháng thể kháng gamma globulin nhuộm màu lên tiêu bản, thì kháng thể kháng thể này cũng bị trôi đi khi rửa nước, nên khi quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang không thấy phát sáng, đó là phản ứng âm tính, bệnh phẩm không chứa virus dại.