2.3.1.1. Sơ chế da cá tra
Bước 1:Ngâm muối
Sau khi cắt nhỏ da cá ta tiến hành ngâm muối ở nồng độ bão hòa. Lượng muối NaCl cho vào trong nước cất để đạt độ bão hòa cần thiết được xác định theo thực nghiệm.
Mục đích: nhằm rửa sạch các tạp chất bẩn, tẩy mỡ, máu, mùi tanh, chất nhờn, cắt đứt các mạch polypeptide của Collagen thành các đoạn peptide ngắn. Và các mạch này trở nên lỏng lẻo, tạo điều kiện cho quá trình trích ly được dễ dàng, hiệu suất thu hồi gelatin cao.
Trong công đoạn này ta tiến hành khảo sát tỉ lệ ngâm muối và thời gian ngâm muối để tìm ra tỉ lệ và thời gian tối ưu mà ở đó ta thu được gelatin với hiệu suất cao nhất.
Sau khi ngâm da cá ta lấy ra rồi rửa sạch đến hết mỡ, chất nhờn, bỏ vào bercher rồi tiến hành trích gelatin bằng nước cất ở nhiệt độ cao. Trong công đoạn này ta tiến hành khảo sát tỉ lệ nước với da, nhiệt độ trích và thời gian trích.
2.3.1.2. Thủy phân phụ phẩm da cá tra
* Xác định pH của quá trình thủy phân phụ phẩm da cá tra
Nhằm đánh giá ảnh hưởng cũng như xác định được khoảng pH tối ưu cho quá trình thủy phân sản phẩm da cá tra bằng enzyme gelatinase tái tổ hợp ở quy mô phòng thí nghiệm.
Tiến hành:
Sử dụng dung dịch NaOH 2M trung hòa các mẫu da cá tra sau tiền xử lý về các giá trị pH khác nhau: 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9. Sau đó bổ sung 5% enzyme Gelatinse tái tổ hợp (1000U/mg), độ tinh sạch 90% rồi tiến hành thủy phân trong thời gian 3 giờ.
* Xác định nhiệt độ tối ưu cho quá trình thủy phân phụ phẩm da cá tra. Xác định được ảnh hưởng cũng như xác định được nhiệt độ tối ưu cho quá trình thủy phân sản phẩm phụ phẩm cá tra bằng enzyme gelatinase tái tổ hợp ở qui mô phòng thí nghiệm.
Trong nghiên cứu ở quy mô PTN, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trong các bình tam giác dung tích 250ml với thể tích mẫu dịch thủy phân là 100ml. Các mẫu da cá tra đồng đều được đưa về pH=7,5 sau đó bổ sung 5% enzyme Gelatinase tái tổ hợp (1000U/mg), độ tinh sạch 90%. Nhiệt độ thủy phân được đánh giá thử nghiệm ở: 300C, 310C, 320C, 330C, 340C, 350C, 360C, 370C, 380C, 390C, 400C. Quá trình thủy phân có kết hợp với lắc bằng máy lắc ở số vòng 150 vòng/phút trong thời gian 3 giờ.
* Xác định thời gian tối ưu cho quá trình thủy phân phụ phẩm da cá tra. Để xác định được thời gian thủy phân thích hợp nhất cho quá trình thủy phân da cá tra ở qui mô PTN, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trong các bình tam giác dung tích 250ml với thể tích mẫu dịch thủy phân là 100ml.
Các mẫu phụ phẩm cá tra/basa đã được tiền xử lý có pH=7,5 được bổ sung 5% enzyme Gelatinase tái tổ hợp (1000U/mg), độ tinh sạch 90%. Tiến hành gia nhiệt với nhiệt độ thích hợp trong: 2h, 3h, 4h, 5h, 6h, 7h.
2.3.1.3. Phương pháp sấy phun
Trước hết, tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ không khí sấy, tốc độ bơm nhập liệu tới quá trình sấy phun và khoảng biến thiên của chúng. Sấy phun dịch thủy phân với nhiệt độ không khí vào là 1300C; áp suất vòi phun: 1,2 bar; tốc độ bơm nhập liệu: 30 ml/phút.
Để khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ không khí sấy, dịch thủy phân phun được phối trộn với maltodextrin theo tỷ lệ khối lượng maltodextrin/tổng chất khô hòa tan của dịch thủy phân là 54%. Tiến hành sấy phun với tốc độ bơm nhập liệu 30ml/phút, áp suất vòi phun 1,2 bar và nhiệt độ sấy thay đổi lần lượt 1100C, 1200C, 1300C, 1400C, 1500C, 1600C.
Ảnh hưởng của tốc độ bơm nhập liệu tới quá trình sấy phun được xác định bằng cách lấy dịch thủy phân được phối trộn maltodextrin theo tỷ lệ khối lượng maltodextrin/tổng chất khô hòa tan của dịch thủy phân là 54%. Tiến hành sấy phun với nhiệt độ không khí vào 1300C, áp suất vòi phun 1,2 bar, tốc độ bơm nhập liệu thay đổi 10,20,30,40,50 ml/phút.
2.3.1.4. Phương pháp DNFB (xác định độ thuỷ phân)
Độ thuỷ phân được xác định theo phương pháp DNFB được mô tả bởi Nguyên và cộng sự (2011). Thu hồi Nitơ được xác định theo Liaset và cộng sự (2002) như sau:
Thu hồi Nitơ = lượng Nitơ tổng số trong sản phẩm thuỷ phân (g) x 100/lượng Nitơ tổng số trong mẫu da cá sau khi xử lý đem đi thuỷ phân (g).
Theo Benjakul và Morrisesey (1997) sự thu hồi Nitơ (protein) phản ánh tỷ lệ Nitơ (protein) thu hồi được trong sản phẩm thuỷ phân.
2.3.1.5. Phương pháp xác định hàm lượng nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldah
Nguyên lý:
Tất cả các dạng nito có trong cơ thể hay các mô được gọi là nito tổng số. Nito có trong thành phần amino acid của protein là nito protein. Nito không có trong thành phần protein như của các muối vơ cơ, acid nitric, các
amino acid tự do, các peptid,ure và các dẫn xuất ure, purin và pirimidin… là nito phi protein.
Nito tổng số = nito protein + nito phi protein
Tiến hành:
- Đốt đạm: Cho 1g mẫu, 5g chất xúc tác (K2SO4 và CuSO4) và 10ml H2SO4 đậm đặc vào bình Kjeldahl và đun trên bếp từ từ cho đến khi thu được dung dịch trong suốt không màu hoặc có màu xanh lơ của CuSO4 để nguội.
Chú ý:
Quá trình vô cơ hóa mẫu trong bình Kjelhdahl giải phóng khí SO2 nên phải tiến hành trong tử hút.
Trong quá trình đốt nên đặt bình nằm hơi nghiêng trên bếp.
- Cất đạm: Sau khi vô cơ hóa mẫu hoàn toàn, cho một ít nước cất vào bình Kjeldahl để tráng rồi cho vào bình định mức 500ml, tráng rửa bình Kjeldahl và phễu vài lần rồi cho vào bình định mức và cho khoảng 10÷15ml NaOH 40% và vài giọt phenoltalein vào bình định mức, sau đó thêm nước cất vừa đủ 300ml.
Chuẩn bị dung dịch ở bình hứng NH3: dùng pipet cho vào bình hứng khoảng 10ml acid Boric, sau đó lắp vào hệ thống sao cho đầu ống sinh hàn ngập trong dung dịch acid Boric. Bắt đầu quá trình cất đạm cho đến khi dung dịch trong bình hứng đạt khoảng 150ml.
2.3.1.6. Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Cách tiến hành:
- Mẫu dịch thuỷ phân phụ phẩm chế biến cá tra được chấm trực tiếp trên bản mỏng. Mẫu bột axit amin sau khi sấy khô được hoà tan trong dung môi hữu cơ phù hợp, nồng độ 2-5% dung môi hoà tan mẫu không nhất thiết phải là dung môi giải ly.
- Cắt tấm bản mỏng nhỏ (5x2 cm), dùng bút chì kẻ một đường thằng phía dưới bảng cao 1cm làm mức xuất phát. Một đường thẳng phía trên bản mỏng cao 0,5cm làm tiền tuyến dung môi.
- Hút 10 microlit dịch phân tích nhỏ vào tấm bản mỏng tại vị trí xuất phát. Nhanh chóng nhấc vi quản rời khỏi tấm bản mỏng để vết chấm chỉ lan rộng ra thành vết tròn có đường kính 2-5 mm.
- Sau khi chấm xong sấy nhẹ để dung môi bay ra khỏi vết chấm rồi nhúng vào dung dịch giải ly.
- Nếu cần khảo sát một lượt các mẫu khác nhau, chuẩn bị và chấm mỗi mẫu một vết trên bản mỏng. Vết này cách vết kia 1cm, hai vết ở ngoài bìa phải cách bờ khoảng 1,5cm.
Giải ly bản mỏng:
- Pha dung môi (hệ dung môi) phủ hợp cho vào bình giải ly có đặt sẵn một tấm giấy thấm (giấy lọc), nghiêng đảo nhẹ để dung môi thấm ướt tờ giấy lọc (làm dung môi trong bình được bão hoà).
- Đặt tấm bản mỏng vào bình giải ly, cạnh đáy của bản mỏng chạm vào đáy của bình và ngập trong dung môi. Các vết chấm mẫu không được chạm vào dung môi.
- Khi dung môi đến mức tiền tuyến (vạch phía trên) bản mỏng thì ngưng quá trình giải ly. Lấy bản mỏng ra sấy khô dung môi. Tiến hành hiện hình mẫu thử bằng các thuốc thử đặc trưng.
- Bản mỏng sau khi giải ly xong, sấy khô, đặt bản mỏng vào đèn UV, quan sát màu và dùng bút chì khoanh vach sắc ký để so sánh mẫu chuẩn và mẫu phân tích.