Nhu cầu dinh dưỡng của cá loài cá biển thường cao hơn nhiều so với cá nước ngọt. Thức ăn công nghiệp sử dụng để nuôi thương phẩm thường có hàm lượng protein từ 40-50% và lipid từ 10-20%.
Việc bổ sung axit amin tổng hợp vào thức ăn để tăng giá trị dinh dưỡng đã được ứng dụng trên nhiều loài động vật thủy sản. Ở tôm he Nhật bản khi sử dụng casein có bổ sung thêm methionin, sinh trưởng của tôm được cải thiện, đối với tôm càng xanh, tốc độ tăng trưởng của tôm gia tăng khi bổ sung thêm vào thức ăn công nghiệp lysine, methionin. Tuy nhiên, một vài nghiên cứu cho thấy, không thành công khi bổ sung thêm axit amin vào thức ăn mặc dù thức ăn này đang thiếu những axit amin này như ở tôm Palaemon serratus, hoặc ở tôm he Nhật bản khi bổ sung arginin. Ở một số loài cá khi sử dụng bột đậu nành có bổ sung thêm lysin cũng không đạt kết quả. Nguyên nhân được giải thích là trong một số trường hợp khi bổ sung thêm 1-2 axit amin tổng hợp, các axit amin này sẽ được ĐVTS hấp thu nhanh hơn so với axit amin của protein thức ăn, bởi vì axit amin của thức ăn phải qua quá trình dị hóa trước khi được hấp thu. Điều này dẫn đến không cùng thời điểm của các axit amin tại vị trí tổng hợp protein. Hơn nữa, Rumsey (1990) chứng minh rằng, giá trị sinh vật học của protein được cải thiện khi được bổ sung nhiều loại axit amin.
Nhiều nghiên cứu ở trong và ngoài nước cho thấy, các loài cá biển không có khả năng tự tổng hợp các loại axit amin thiết yếu mà phải lấy từ bên ngoài qua đường thức ăn. Trong quá trình chế biến thức ăn, thực tế các loại axit amin bị hao hụt trong quá trình sấy, phun, hấp...thức ăn về hàm lượng. Qua các nghiên cứu Lê Anh Tuấn (2007) và Phạm Mỹ Dung, Nguyễn Lê Hoàng (2014) có sử dụng thức ăn bổ sung axit amin trong ương nuôi cá Mú, đạt kết quả khả quan. Ngoài ra, một số kết quả nghiên cứu về nhu cầu sử dụng axit amin của cá bớp giai đoạn
giống như: Methionine là 11,9g/kg-1 (có bổ sung 6,7g Cystenine kg-1 thức ăn), Lysine và Arginine lần lượt là 23,3 và 28,2 (Ren & ctv,2012; Zhou & ctv, 2007). Việc bổ sung hàm lượng Taurine với liều lượng 5 g/kg-1 thức ăn có tác dụng tăng tốc độ tăng trưởng và hiệu quả chuyển đổi thức ăn trên cá bớp (Langer & ctv, 2007). Trong số các axit amin thì Lysine và Arganine có tác dụng tới tăng trưởng và quá trình sinh hóa của cá.
Trên thực tế, phụ phẩm chế biến da cá tra rất nhiều, thành phần da chiếm hơn 6% khối lượng thân cá. Qua quá trình tách chiết Colagen, Gelatine...thủy phân thành axit amin nhỏ hơn và ứng dụng vào trong dược phẩm và thức ăn chăn nuôi. Trong quá trình tạo ra chế phẩm axit amin có sử dụng hóa chất độc hại, lâu ngày sẽ gây độc hại. Dựa vào đó, chúng tôi muốn sử dụng phương pháp tách chiết tạo chế phẩm axit amin bằng enzyme thủy phân da cá tra.
1.5. Nguồn nguyên liệu da cá
Họ cá Tra có tên khoa học là Pangasiidae, cá Tra phân bố rộng ở khu vực Tây Nam Á. Cá Tra là loài ăn tạp, trong tự nhiên cá ăn mùn bã hữu cơ, rễ cây thủy sinh, rau quả, các loài cá tạp nhỏ, tôm, tép, cua và các loại côn trùng nhỏ có sẵn trong môi trường sống.
Năm 2012, cá Tra Việt Nam được xuất khẩu sang 142 quốc gia và vùng lãnh thổ, tăng so với cùng kỳ của năm 2011. Đạt giá trị 1,744 tỷ USD, giảm 3,4% so với năm 2011.
Hiện nay, tại các tỉnh/thành phố vùng Đồng bằng Sông Cửu Long có 3.749 héc ta nuôi cá tra, trong đó Đồng Tháp, An Giang với 2.340 héc ta. Do có ưu điểm như dễ nuôi, lớn nhanh, thịt ngon nên tiềm năng nuôi cá Tra vẫn còn khá lớn. Việc phát triển nuôi cá Tra sẽ làm tăng sản lượng cá nuôi nước ngọt trong cả nước, tăng thêm lượng thủy sản xuất khẩu và góp phần phát triển ổn định nghề nuôi.
Tuy nhiên, so với năm 2009, trong những tháng qua, giá cá tra trên thị trường quốc tế giảm từ 2,28 đô la Mỹ xuống còn 2,13 đôla Mỹ/kg, đã gây khó
khăn không ít cho các doanh nghiệp xuất khẩu. Điều này khiến nhiều doanh nghiệp quan tâm hơn tới việc tăng doanh thu từ các nguồn khác như các mặt hàng chế biến sẵn, các mặt hàng giá trị gia tăng, tận dụng phế phẩm của quá trình phi lê (da, mỡ…), đồng thời tăng giá trị sử dụng cho phế phẩm.
Như trên đã nói, hàng năm tại các nhà máy chế biến lượng da cá thải ra rất lớn.
Ước tính lượng phụ phẩm từ công nghiệp chế biến cá Tra hàng năm lên đến 700.000 tấn/năm, đây là một con số rất lớn, nếu tận dụng hợp lý sẽ thu lại một lợi nhuận đáng kể. Từ thực trạng và bài toán kinh tế đó, Công ty Cổ phần Vĩnh Hoàn, Đồng Tháp là công ty đầu tiên trong nước xây dựng nhà máy sản xuất collagen từ da cá tra/ cá ba sa với công xuất 1000 tấn/ năm. Theo dự báo kết quả kinh doanh nhà máy sản xuất collagen của công ty này, ngay trong năm đầu hoạt động - năm 2012, lợi nhuận sau thuế có thể đạt xấp xỉ 1,1 triệu USD, hay tỉ suất lợi nhuận trên doanh thu là khoảng 15%.
Từ collagen trong da cá, theo nghiên cứu của tác giả Trần Thanh Nhãn, 2009, hiệu xuất chiết tách gelatin từ da cá tra/ cá basa đạt 16%, nguồn gelatine này đạt các tiêu chuẩn dược điển Việt Nam III, hoàn toàn an toàn đối với vật nuôi và con người có thể sử dụng trong ngành thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Tuy nhiên, một vấn đề đặt ra là cùng với lượng chính phẩm thủy sản khai thác được thì các loại phụ phẩm sau chế biến cũng là một vấn đề rất đáng quan tâm. Theo kết quả điều tra tại các nhà máy chế biến, tỷ lệ phi lê cá Tra đạt khoảng 35% còn lại 65% là phế phẩm như xương, da, thịt vụn, nội tạng, mỡ. Với tỷ lệ 6% trong phụ phẩm thì trong một năm vùng ĐBSCL sản xuất khoảng 600.000 tấn cá Tra phi lê sẽ có khoảng 85-100 tấn da cá được thải ra ở hơn 1000 nhà máy phi lê cá. Nếu không tận thu lượng phụ phẩm sau chế biến này sẽ gây thất thoát lãng phí lớn trong sản xuất và ô nhiễm môi trường. Trong khi đó, từ collagen trong da cá, theo nghiên cứu của tác giả Trần Thanh Nhãn, 2009, hiệu suất chiết tách gelatin từ da cá tra/ cá basa đạt 16%, nguồn gelatine này đạt các tiêu chuẩn dược điển Việt Nam III, hoàn toàn an toàn đối với vật nuôi và con người có thể
sử dụng trong ngành thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Điều này, có thể áp dụng cho Việt Nam trong hoàn cảnh hiện nay, khi cá Tra/ba sa nguyên liệu rất khó xuất khẩu, phụ phẩm cá tra chưa được tận dụng đúng mức, lãng phí. Bên cạnh đó, trong một vài năm trở lại đây do ảnh hưởng của sự suy thoái kinh tế cộng với thuế áp chống bán phá giá của Mỹ và một số nước phương Tây làm cho nghề nuôi trồng cũng như các nhà máy chế biến gặp không ít khó khăn. Cùng với đó là sự phát triển mạnh mẽ của nghề nuôi cá biển cả về số lượng, chất lượng nên đòi hỏi một lượng lớn nhu cầu về thức ăn thủy sản. Vì thế, các doanh nghiệp hiện nay đang hướng sự quan tâm hơn tới việc tăng doanh thu từ các nguồn khác như các mặt hàng chế biến sẵn, các mặt hàng giá trị gia tăng, tận dụng phụ phẩm của quá trình phi lê, tăng giá trị sử dụng cho nguồn phụ phẩm này.
• Cấu tạo da cá
Da cá có thể chia thành 3 lớp:
- Lớp trong chủ yếu là lipit và thịt vụn còn sót. - Lớp giữa có thành phần chủ yếu là collagen
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: cá Hồng Mỹ (Sciaenops ocellatus,Linnaeus 1766), cỡ cá 5,013 cm.
- Da cá tra được lấy từ Công ty cổ phần Vĩnh Nguyên, khu công nghiệp Trà Nóc Thành phố Cần Thơ.
- Chế phẩm axit amin thủy phân từ da cá tra.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu tạo chế phẩm axit amin thủy phân từ da cá.
- Thử nghiệm bổ sung chế phẩm axit amin thủy phân từ da cá tra vào thức ăn ương nuôi cá Hồng Mỹ giai đoạn giống.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Nghiên cứu tạo chế phẩm axit amin thủy phân từ da cá tra2.3.1.1. Sơ chế da cá tra2.3.1.1. Sơ chế da cá tra2.3.1.1. Sơ chế da cá tra 2.3.1.1. Sơ chế da cá tra
Bước 1:Ngâm muối
Sau khi cắt nhỏ da cá ta tiến hành ngâm muối ở nồng độ bão hòa. Lượng muối NaCl cho vào trong nước cất để đạt độ bão hòa cần thiết được xác định theo thực nghiệm.
Mục đích: nhằm rửa sạch các tạp chất bẩn, tẩy mỡ, máu, mùi tanh, chất nhờn, cắt đứt các mạch polypeptide của Collagen thành các đoạn peptide ngắn. Và các mạch này trở nên lỏng lẻo, tạo điều kiện cho quá trình trích ly được dễ dàng, hiệu suất thu hồi gelatin cao.
Trong công đoạn này ta tiến hành khảo sát tỉ lệ ngâm muối và thời gian ngâm muối để tìm ra tỉ lệ và thời gian tối ưu mà ở đó ta thu được gelatin với hiệu suất cao nhất.
Sau khi ngâm da cá ta lấy ra rồi rửa sạch đến hết mỡ, chất nhờn, bỏ vào bercher rồi tiến hành trích gelatin bằng nước cất ở nhiệt độ cao. Trong công đoạn này ta tiến hành khảo sát tỉ lệ nước với da, nhiệt độ trích và thời gian trích.
2.3.1.2. Thủy phân phụ phẩm da cá tra
* Xác định pH của quá trình thủy phân phụ phẩm da cá tra
Nhằm đánh giá ảnh hưởng cũng như xác định được khoảng pH tối ưu cho quá trình thủy phân sản phẩm da cá tra bằng enzyme gelatinase tái tổ hợp ở quy mô phòng thí nghiệm.
Tiến hành:
Sử dụng dung dịch NaOH 2M trung hòa các mẫu da cá tra sau tiền xử lý về các giá trị pH khác nhau: 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9. Sau đó bổ sung 5% enzyme Gelatinse tái tổ hợp (1000U/mg), độ tinh sạch 90% rồi tiến hành thủy phân trong thời gian 3 giờ.
* Xác định nhiệt độ tối ưu cho quá trình thủy phân phụ phẩm da cá tra. Xác định được ảnh hưởng cũng như xác định được nhiệt độ tối ưu cho quá trình thủy phân sản phẩm phụ phẩm cá tra bằng enzyme gelatinase tái tổ hợp ở qui mô phòng thí nghiệm.
Trong nghiên cứu ở quy mô PTN, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trong các bình tam giác dung tích 250ml với thể tích mẫu dịch thủy phân là 100ml. Các mẫu da cá tra đồng đều được đưa về pH=7,5 sau đó bổ sung 5% enzyme Gelatinase tái tổ hợp (1000U/mg), độ tinh sạch 90%. Nhiệt độ thủy phân được đánh giá thử nghiệm ở: 300C, 310C, 320C, 330C, 340C, 350C, 360C, 370C, 380C, 390C, 400C. Quá trình thủy phân có kết hợp với lắc bằng máy lắc ở số vòng 150 vòng/phút trong thời gian 3 giờ.
* Xác định thời gian tối ưu cho quá trình thủy phân phụ phẩm da cá tra. Để xác định được thời gian thủy phân thích hợp nhất cho quá trình thủy phân da cá tra ở qui mô PTN, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trong các bình tam giác dung tích 250ml với thể tích mẫu dịch thủy phân là 100ml.
Các mẫu phụ phẩm cá tra/basa đã được tiền xử lý có pH=7,5 được bổ sung 5% enzyme Gelatinase tái tổ hợp (1000U/mg), độ tinh sạch 90%. Tiến hành gia nhiệt với nhiệt độ thích hợp trong: 2h, 3h, 4h, 5h, 6h, 7h.
2.3.1.3. Phương pháp sấy phun
Trước hết, tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ không khí sấy, tốc độ bơm nhập liệu tới quá trình sấy phun và khoảng biến thiên của chúng. Sấy phun dịch thủy phân với nhiệt độ không khí vào là 1300C; áp suất vòi phun: 1,2 bar; tốc độ bơm nhập liệu: 30 ml/phút.
Để khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ không khí sấy, dịch thủy phân phun được phối trộn với maltodextrin theo tỷ lệ khối lượng maltodextrin/tổng chất khô hòa tan của dịch thủy phân là 54%. Tiến hành sấy phun với tốc độ bơm nhập liệu 30ml/phút, áp suất vòi phun 1,2 bar và nhiệt độ sấy thay đổi lần lượt 1100C, 1200C, 1300C, 1400C, 1500C, 1600C.
Ảnh hưởng của tốc độ bơm nhập liệu tới quá trình sấy phun được xác định bằng cách lấy dịch thủy phân được phối trộn maltodextrin theo tỷ lệ khối lượng maltodextrin/tổng chất khô hòa tan của dịch thủy phân là 54%. Tiến hành sấy phun với nhiệt độ không khí vào 1300C, áp suất vòi phun 1,2 bar, tốc độ bơm nhập liệu thay đổi 10,20,30,40,50 ml/phút.
2.3.1.4. Phương pháp DNFB (xác định độ thuỷ phân)
Độ thuỷ phân được xác định theo phương pháp DNFB được mô tả bởi Nguyên và cộng sự (2011). Thu hồi Nitơ được xác định theo Liaset và cộng sự (2002) như sau:
Thu hồi Nitơ = lượng Nitơ tổng số trong sản phẩm thuỷ phân (g) x 100/lượng Nitơ tổng số trong mẫu da cá sau khi xử lý đem đi thuỷ phân (g).
Theo Benjakul và Morrisesey (1997) sự thu hồi Nitơ (protein) phản ánh tỷ lệ Nitơ (protein) thu hồi được trong sản phẩm thuỷ phân.
2.3.1.5. Phương pháp xác định hàm lượng nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldah
Nguyên lý:
Tất cả các dạng nito có trong cơ thể hay các mô được gọi là nito tổng số. Nito có trong thành phần amino acid của protein là nito protein. Nito không có trong thành phần protein như của các muối vơ cơ, acid nitric, các
amino acid tự do, các peptid,ure và các dẫn xuất ure, purin và pirimidin… là nito phi protein.
Nito tổng số = nito protein + nito phi protein
Tiến hành:
- Đốt đạm: Cho 1g mẫu, 5g chất xúc tác (K2SO4 và CuSO4) và 10ml H2SO4 đậm đặc vào bình Kjeldahl và đun trên bếp từ từ cho đến khi thu được dung dịch trong suốt không màu hoặc có màu xanh lơ của CuSO4 để nguội.
Chú ý:
Quá trình vô cơ hóa mẫu trong bình Kjelhdahl giải phóng khí SO2 nên phải tiến hành trong tử hút.
Trong quá trình đốt nên đặt bình nằm hơi nghiêng trên bếp.
- Cất đạm: Sau khi vô cơ hóa mẫu hoàn toàn, cho một ít nước cất vào bình Kjeldahl để tráng rồi cho vào bình định mức 500ml, tráng rửa bình Kjeldahl và phễu vài lần rồi cho vào bình định mức và cho khoảng 10÷15ml NaOH 40% và vài giọt phenoltalein vào bình định mức, sau đó thêm nước cất vừa đủ 300ml.
Chuẩn bị dung dịch ở bình hứng NH3: dùng pipet cho vào bình hứng khoảng 10ml acid Boric, sau đó lắp vào hệ thống sao cho đầu ống sinh hàn ngập trong dung dịch acid Boric. Bắt đầu quá trình cất đạm cho đến khi dung dịch trong bình hứng đạt khoảng 150ml.
2.3.1.6. Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Cách tiến hành:
- Mẫu dịch thuỷ phân phụ phẩm chế biến cá tra được chấm trực tiếp trên bản mỏng. Mẫu bột axit amin sau khi sấy khô được hoà tan trong dung môi hữu cơ phù hợp, nồng độ 2-5% dung môi hoà tan mẫu không nhất thiết phải là dung môi giải ly.
- Cắt tấm bản mỏng nhỏ (5x2 cm), dùng bút chì kẻ một đường thằng phía dưới bảng cao 1cm làm mức xuất phát. Một đường thẳng phía trên bản mỏng cao 0,5cm làm tiền tuyến dung môi.
- Hút 10 microlit dịch phân tích nhỏ vào tấm bản mỏng tại vị trí xuất phát. Nhanh chóng nhấc vi quản rời khỏi tấm bản mỏng để vết chấm chỉ lan rộng ra thành vết tròn có đường kính 2-5 mm.
- Sau khi chấm xong sấy nhẹ để dung môi bay ra khỏi vết chấm rồi nhúng vào dung dịch giải ly.
- Nếu cần khảo sát một lượt các mẫu khác nhau, chuẩn bị và chấm mỗi mẫu một vết trên bản mỏng. Vết này cách vết kia 1cm, hai vết ở ngoài bìa phải cách bờ khoảng 1,5cm.
Giải ly bản mỏng:
- Pha dung môi (hệ dung môi) phủ hợp cho vào bình giải ly có đặt sẵn một