- Nghiên cứu thử nghiệm trong phịng thí nghiệm . - Thử nghiệm thực địa ngẫu nhiên cĩ đối chứng.
2.6. cỡ mẫu vμ chọn mẫu nghiên cứu: 2.6.1. ph−ơng pháp chọn mẫu:
- Chọn xã nghiên cứu: Theo ph−ơng pháp chủ định, Xã Hàm Phú là nơi do điều kiện tự nhiên đất bị nhiễm phèn, nguồn n−ớc th−ờng xuyên bị thiếu, các hộ gia đình cĩ thĩi quen tích trữ n−ớc m−a để sử dụng. Dụng cụ trữ n−ớc ở đây là các bể Unicef, bể hình chữ nhật, hình vuơng, các lu, chum vại, giếng, DCCN th−ờng cĩ thể tích lớn từ 100 lít đến 2000 lít là nơi thích hợp cho muỗi Aedes.aegypti sinh sản, những dụng cụ này cũng là nơi phù hợp cho việc sử dụng Mesocyclops
- Tồn bộ các xĩm của thơn Phú lập, Phú điền và Lâm Thạch bao gồm 18 xĩm, trong đĩ 9 xĩm đ−a đ−ợc chọn thử nghiệm sử dụng Mesocylops, và 9 xĩm đối chứng. Theo ph−ơng pháp ngẫu nhiên đơn
- Chọn hộ gia đình : Chọn mẫu theo ph−ơng pháp ngẫu nhiên đơn hệ thống [ 27] .
+ Lập danh sách tồn bộ chủ hộ gia đình của 18 xĩm trong xã bao gồm 9 xĩm thử và 9 xĩm chứng (khung mẫu), đánh số thứ tự các hộ gia đình liên tục theo xĩm từ hộ đầu tiên đến hộ cuối cùng của từng xĩm.
+ Sử dụng phần mềm Epi-Info 6.4 để chọn ngẫu nhiên 100 hộ gia đình của nhĩm thử trong khung mẫu gồm 613 hộ và 100 hộ gia đình của nhĩm chứng trong khung mẫu gồm 635 hộ cho mỗi đợt điều tra.
+ Tại điểm nghiên cứu tr−ớc khi can thiệp sử dụng Mesocyclops tiến hành điều tra cơ bản để xác định thành phần lồi véc tơ ,ổ bọ gậy nguồn, tập quán sinh hoạt, các loại dụng cụ chứa n−ớc cĩ tại địa ph−ơng.
2.6.2. Chọn cỡ mẫu :
- Chọn lồi Mesocyclops sử dụng trên thực địa (mục đích 1):
Điều tra ít nhất 50 thuỷ vực tại điểm nghiên cứu. Bao gồm những loại thuỷ vực nh− ao hồ, sơng suối, ruộng lúa, và DCCN trong các hộ gia đình.
- Cỡ mẫu sử dụng để đánh giá tính hiệu quả của Mesocylops (mục đích 2) là :
100 hộ gia đình điểm thử và 100 hộ gia đình điểm chứng để điều tra muỗi, bọ gậy và Mesocyclops. (Cỡ mẫu điều tra hộ gia đình để điều tra vetơ và ổ bọ gậy nguồn đ−ợc chọn theo tiêu chuẩn của tổ chức Y tế Thế giới ( WHO 70).
2.7. ph−ơng pháp nghiên cứu
2.7.1. Mesocyclops
Xác định lồi Mesocyclops cĩ tại địa ph−ơng, đánh giá, chọn lồi cĩ khả năng diệt bọ gậy muỗi SXHD cao nhất bằng điều tra thu thập Mesocyclops tại thực địa,
nhân nuơi, đánh giá khả năng diệt bọ gậy trong phịng thí nghiệm. Sau đĩ chọn lồi phù hợp nhân nuơi và phĩng thả.
2.7.1.1. Cách thu thập Mesocyclops
Dùng vợt để thu thập Mesocyclops trong các thuỷ vực tự nhiên và trong các dụng cụ chứa n−ớc sinh hoạt.
− Cấu tạo của vợt: Vợt đ−ợc may bằng vải thống, kích th−ớc lỗ 200 nanơmet, đ−ờng kính miệng vợt 20cm và cĩ cán dài 1,2m.
− Sử dụng vợt: đ−a vợt gần ngập trong n−ớc quay vợt xung quanh thành dụng cụ chứa n−ớc, hoặc gần các cây thuỷ sinh nếu ở thuỷ vực tự nhiên 5 vịng để tạo xốy n−ớc. Rồi dùng vợt bắt Mesocyclops tại xốy n−ớc. Sau khi bắt Mesocyclops lộn trái vợt rồi nhúng đáy vợt vào cốc thuỷ tinh cĩ n−ớc. Sau mỗi lần bắt Mesocyclops tại các thuỷ vực vợt phải đ−ợc rửa sạch để tránh lẫn.
Mẫu thu đ−ợc cố định trong cồn 700 hoặc dung dịch formaldehyde 5% mang về Viện Pasteur Nha Trang để định loại và gửi phịng thí nghiệm Cơn trùng Y học Viện vệ sinh dịch tễ Trung −ơng để kiểm tra. Một phần mẫu đ−ợc giữ sống mang về phịng thí nghiệm để làm thực nghiệm
2.7.1.2. Định loại Mesocyclops
Định loại Mesocyclops là một kỹ thuật khĩ. Định loại trên cá thể cái tr−ởng thành. Mesocyclops cái tr−ởng thành phải đ−ợc mổ tách các bộ phận: 2 đơi ăng ten, đuơi, các đơi chân 5, 4, 3, 2, 1, và bộ phận hàm. Đặt trong 1 giọt dung dịch glycerin d−ới kính lúp soi nổi. Sau đĩ đ−ợc định loại theo khố định loại của Maria Holynska Viện bảo tàng động vật học Ba Lan và tài liệu cơ sở xác định một số lồi Mesocyclops tại Việt Nam do Viện VSDT TW biên dịch và biên soạn [28].
2.7.1.3. Nuơi Mesocyclops trong phịng thí nghiệm
Mesocyclops từ thực địa đ−ợc mang về Viện Pasteur Nha Trang nuơi trong hộp bằng nhựa cĩ kích th−ớc 45 x 35 x 18 cm cĩ nắp. Hộp đ−ợc rửa sạch bằng n−ớc
sơi tr−ớc khi sử dụng. Cho vào hộp khoảng 2,5 lít n−ớc. Nếu là n−ớc máy thì phải để sau 72 h để loại bỏ chlorin. Thêm vào đĩ một ít hạt lúa mì hoặc 10cm2 rau xà lách t−ơi để làm thức ăn cho đơn bào paramecium. Đơn bào này sẽ là nguồn thức ăn cho Mesocyclops và bọ gậy tuổi 1. Ngồi ra Mesocyclops cĩ thể ăn tảo và các vi sinh vật cĩ sẵn trong n−ớc.
2.7.1.4. Thử nghiệm khả năng ăn bọ gậy Aedes. aegypti của Mesocyclops
Với mỗi lồi Mesocyclops tiến hành 20 lơ thí nghiệm: Mỗi cốc thuỷ tinh cĩ 500ml n−ớc, thả 50 bọ gậy tuổi 1 và 1 Mesocyclops tr−ởng thành. Theo dõi sau 24 h đếm số l−ợng bọ gậy cịn sống sĩt và bọ gậy bị cắn chết. Lơ đối chứng đ−ợc thực hiện t−ơng tự nh−ng khơng cĩ Mesocyclops.
Số l−ợng bọ gậy tuổi 1 bị ăn và cắn chết = Tổng số bọ gậy - số bọ gậy cịn sống sĩt.
Khả năng ăn và cắn chết bọ gậy trung bình của một Mesocyclops = tổng số bọ gậy tuổi 1 bị ăn và cắn chết / tổng số lơ thí nghiệm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.7.2.Muỗi tr−ởng thành
Kỹ thuật điều tra muỗi: (Theo th−ờng qui của Viện VSDTTW)
Điều tra muỗi bằng soi bắt muỗi đậu nghỉ trong nhà 2 ng−ời, 15 phút. Ng−ời bắt muỗi tay phải cầm ống nghiệm, tay trái cầm đèn pin soi, đi từ ngồi vào trong, quan sát ở những nơi kín giĩ, tối nh− bàn thờ , dây phơi, mắc quần áo, mùng treo,…v.v. đi nhẹ khi phát hiện thấy muỗi đậu nghỉ thì từ từ dùng ống nghiệm úp lên muỗi và khẽ động nhẹ ống nghiệm để muỗi bay vào sau đĩ dùng bơng nút lại. Sau khi bắt xong mỗi nhà thì ghi nhãn, ghi rõ địa chỉ, thời gian bắt, số l−ợng, ghi kết quả vào phiếu điều tra. Quá trình điều tra muỗi tr−ởng thành cứ tiếp tục nh− vậy cho hết 100 nhà. Sau đĩ đem về phịng thí nghiệm để định loại và đếm số l−ợng.
2.7.3. Bọ gậy Aedes
− Đối với dụng cụ chứa n−ớc trung bình và lớn: thu thập bằng vợt .
− Cấu tạo của vợt: Vợt đ−ợc may bằng vải thống, kích th−ớc lỗ 200 nanơmet, đ−ờng kính miệng vợt 20cm và cĩ cán dài 1,2m.
− Sử dụng vợt: đ−a vợt gần ngập trong n−ớc quay vợt xung quanh thành dụng cụ chứa n−ớc 5 vịng để tạo xốy n−ớc , rồi dùng vợt bắt bọ gậy tại xốy n−ớc. Sau khi bắt bọ gậy lộn trái vợt rồi nhúng đáy vợt vào cốc thuỷ tinh cĩ n−ớc, sau đĩ đổ ra khay dùng pipet để thu thập bọ gậy cho vào hộp đựng nhựa.
− Đối với dụng cụ chứa n−ớc nhỏ: Đổ hết n−ớc lọc bọ gậy bằng vợt, lộn trái vợt, nhúng đáy vợt vào cốc thuỷ tinh cĩ n−ớc sau đĩ chuyển bọ gậy vào hộp nhựa.
− Đối với dụng cụ chứa n−ớc lớn nh− giếng khơi, bể ngầm và hầm ngầm thì sử dụng bẫy phễu.
− Các mẫu bọ gậy thu đ−ợc đều đ−ợc bỏ vào hộp nhựa dung tích từ 10 - 20 ml cĩ cồn700 hoặc vài giọt formaldehyd đem về phịng thí nghiệm để định loại và đếm số l−ợng.
+ Cấu tạo của bẫy phễu:
Bẫy phễu do phịng thí nghiệm cơn trùng Viện VSDTTƯ thiết kế cĩ cấu tạo gồm một phễu nhựa (cĩ đ−ờng kính miệng phễu 19cm, đ−ờng kính cuống phễu 2cm; chiều cao miệng phễu 5cm, cao tồn bộ 9cm, cĩ nắp). Nắp hộp, đai đối trọng (là một vịng kim loại cĩ đ−ờng kính 3cm, cao 1 cm) và phễu đ−ợc gắn bởi 2 đinh vít. Phần miệng phễu cĩ lỗ buộc dây để ng−ời sử dụng cĩ thể dễ dàng cho việc đặt, thu bẫy ở những dụng cụ chứa n−ớc sâu: bể lớn, giếng...
+ Nguyên tắc sử dụng:
Sử dụng cho giếng khơi và những dụng cụ chứa n−ớc lớn khơng thể dùng vợt đ−ợc. Mở nắp hộp của bẫy phễu, đổ n−ớc vào 2/3 hộp, đậy nắp và thả bẫy vào dụng cụ chứa n−ớc, Thời gian đặt bẫy từ 16 giờ đến 8 giờ sáng hơm sau. Sau khi thu bẫy
(kéo dây buộc miệng phễu lên), mở nắp hộp và đếm số l−ợng bọ gậy trên khay bằng pipét rồi cho tất cả vào lọ mang về phịng thí nghiệm để định lồi.
Hình 2.2. Bẫy phễu để bẫy bọ gậy Aedes
2.7.3.2. Trong phịng thí nghiệm
− Bọ gậy thuần chủng đ−ợc nuơi trong hộp nhựa dung tích khoảng 2 lít, ăn thức ăn đặc chủng (bột cá nghiền nhỏ) đ−ợc thay n−ớc hàng ngày để tránh nhiễm bẩn.
− Muỗi đ−ợc nuơi trong các lồng, hàng ngày cho hút máu chuột để thu thập trứng phục vụ cho thí nghiệm.
− Trứng muỗi Aedes aegypti đ−ợc thu thập từ các bẫy trứng bằng những băng giấy thấm trong các lồng nuơi muỗi, những miếng giấy cĩ trứng đ−ợc sẽ ngâm trong vịng 24h ta cĩ đ−ợc bọ gậy tuổi 1 để làm thức ăn cho quá trình thử nghiệm.
2.7.2.3. Định loại muỗi và bọ gậy theo khố định loại của Cherter J. Stojanovitch and Harder, 1965 [ 38 ]
2.7.4. Nhân nuơi Mesocyclops tại các bể nguồn và phĩng thả trên thực địa.
- Thành lập mạng l−ới cộng tác viên nhân nuơi và phĩng thả Mesocyclops , gồm 9 CTV, mỗi cộng tác viên phụ trách từ 60 – 80 hộ gia đình trong 1 xĩm thử nghiệm.
- Tập huấn h−ớng dẫn cách nhân nuơi, kiểm tra và phĩng thả Mesocyclops vào các dụng cụ chứa n−ớc lớn để diệt bọ gậy.
- Sau khi chọn lựa đ−ợc các lồi Mesocyclops cĩ khả năng ăn và cắn chết bọ gậy, các lồi Mesocyclops này sẽ đ−ợc chuyển xuống thực địa và nhân nuơi trong các bể nguồn cĩ dung tích từ 500 đến 1500 lít, ít cĩ các thủy sinh khác sống trong đĩ để làm bể nguồn nhân nuơi Mesocyclops, (mỗi CTV sẽ chọn 10 bể nguồn). 15 - 20 ngày sau kiểm tra tồn tại và phát triển của Mesocyclops . Sau khoảng 1 tháng cộng tác viên sẽ thu hạch Mesocyclops từ các bể nguồn để phĩng thả cho các tất cả các dụng cụ chứa n−ớc cĩ thể tích lớn từ 100 lít trở lên ở tồn bộ 613 hộ gia đình điểm thử, mỗi dụng cụ thả từ 50 đến 100 Mesocyclops, Mesocyclops đ−ợc kiểm tra và phĩng thả bổ sung th−ờng xuyên khi các CTV đi kiểm tra từng hộ gia đình hàng tháng và thơng qua các chiến dịch phĩng thả Mesocyclops đ−ợc thực hiện 2- 3 tháng 1 lần.
2.7.5. Khảo sát một số yếu tố lý hĩa trong mơi tr−ờng tồn tại và phát triển của
Mesocyclops .
Tiến hành thu mẫu n−ớc tại thực địa bao gồm 20 mẫu ở các thủy vực cĩ Mesocyclops và 20 mẫu khơng cĩ Mesocyclops, khảo sát các yếu tố lý hĩa bao gồm độ pH, oxy hịa tan, muối Clorua và NH+
4. Để xác định cĩ sự khác biệt giữa mơi tr−ờng n−ớc cĩ Mesocyclops và khơng cĩ Mesocyclops. Đối với độ pH và oxy hịa tan đ−ợc đo bằng máy Multiline P4 của Đức tại thực địa, nồng độ muối Clorua và NH+4 đ−ợc xét nghiệm tại phịng hĩa n−ớc của Viện Pasteur Nha Trang.
2.7.6. Đánh giá kết quả bằng định kỳ 2 tháng điều tra 1 lần, so sánh sự hiện diện của Mesocyclops và bọ gậy Aedes trong các dụng cụ chứa n−ớc. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đánh giá hiệu quả sẽ dựa trên kết quả giám sát vectơ bằng ph−ơng pháp bắt muỗi đậu nghỉ, điều tra bọ gậy, sự phát triển của quần thể Mesocyclops và sự chấp nhận tham gia của cộng đồng.
Thu thập số liệu bằng các biểu mẫu điều tra in sẵn của Viện vệ sinh dịch tễ Trung −ơng, ( phụ lục 1).
2.8. Xử lý số liệu:
Bằng phần mềm Excel và Epi-info 6.4
Trong luận văn cĩ sử dụng số liệu về tìm hiểu sự phân bố và một vài đặc điểm sinh học của Mesocylops tại khu vực miền Trung tr−ớc đây do Viện Vệ Sinh Dịch Tễ trung Ương và Viện Pasteur Nha Trang thực hiện cĩ sự tham gia của tác giả.
2.9. Một số định nghĩa, giải thích thuật ngữ
− Chỉ số mật độ muỗi là số muỗi cái Aedes aegypti trung bình trong một gia đình điều tra.
(DI: Density Index)
Số muỗi cái Aedes.aegypti bắt đ−ợc CSMD( con/nhà) =
Số nhà điều tra
− Chỉ số nhà cĩ muỗi: là tỷ lệ phần trăm nhà cĩ muỗi Aedes aegypti tr−ởng thành.
(HI: House Index) : Chỉ số nhà cĩ muỗi
Số nhà cĩ muỗi Aedes.aegypti CSNCM(HI)% =
Số nhà điều tra
x 100
− Chỉ số nhà cĩ bọ gậy/ quăng: là tỷ lệ % nhà cĩ bọ gậy/ quăng Aedes (HIL: House Index Larva) : Chỉ số nhà cĩ bọ gậy
Số nhà cĩ bọ gậy/ quăng Aedes CSNCBG% =
Số nhà điều tra
x 100
- Chỉ sốdụng cụ chứa n−ớc cĩ bọ gậy: (CI: Container Index) là tỷ lệ % DCCN cĩ bọ gậy/quăng Aedes:
Số DCCN điều tra
- Chỉ số Breteau: (BI) là số DCCN cĩ bọ gậy/ quăng trong 100 nhà điều tra. Trong thực tế sử dụng cơng thức sau:
Số DCCN cĩ bọ gậy/ quăng Aedes CSBI =
Số nhà điều tra
x 100
- Chỉ số mật độ bọ gậy: (CSMĐBG) là số bọ gậy trung bình trong 1 nhà điều tra.
Số bọ gậy Aedes thu thập đ−ợc CSMĐBG =
(Con/nhà)
Số nhà điều tra
Thuật ngữ: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Bọ gậy bị ăn: Mesocyclops ăn và nuốt bọ gậy.
- Bọ gậy bị cắn là: Mesocyclops cắn ngang thân của bọ gậy, và làm bọ gậy chết.
- DCCN (+) là dụng cụ chứa n−ớc cĩ bọ gậy hoặc quăng của muỗi Aedes. - Tỷ lệ nhiễm là % DCCN cĩ bọ gây hoặc quăng Aedes aegypti / tổng số DCCN của chủng loại đĩ.
- ổ bọ gậy nguồn: là bất kỳ DCCN đơn lẻ hoặc chủng loại DCCN nào cĩ chứa một số lớn bọ gậy hoặc quăng Aedes aegypti và do đĩ sẽ tạo ra số l−ợng lớn muỗi Aedes aegypti tr−ởng thành.
ổ bọ gây nguồn đ−ợc xác định dựa vào tỷ lệ tập trung bọ gậy trong mỗi chủng loại DCCN, cách tính :
Tỷ lệ tập trung bọ gậy =
Số bọ gậy Aedes aegypti bắt đ−ợc trong 1 chủng loại DCCN
Tổng số bọ gậy Aedes aegypti bắt đ−ợc trong đợt điều tra
x 100
Số l−ợng bọ gậy sau khi thu đ−ợc sẽ đ−ợc tính theo bảng hệ số t−ơng ứng với tùng lọai DCCN.
- Thuỷ vực: là nơi chứa n−ớc tự nhiên hay nhân tạo nh−: sơng, suối, ao, hồ, giếng... và DCCN sinh hoạt.
- Dụng cụ chứa n−ớc (DCCN): là tất cả các dụng cụ chứa n−ớc lớn nhỏ khơng phân biệt giá trị sử dụng nh− vậy DCCN bao gồm cả dụng cụ phế thải đọng n−ớc:
- DCCN lớn: là DCCN cĩ thể tích ≥ 100lít. - DCCN trung bình: là ≥ 50lít, < 100lít. - DCCN nhỏ: là < 50lít.
- DCCN cĩ nắp: là DCCN cĩ vật liệu che đậy cĩ khả năng ngăn khơng cho muỗi vào đẻ trứng. Những dụng cụ cĩ nắp che đậy nh−ng khơng kín đ−ợc coi là khơng cĩ nắp.
- Dụng cụ phế thải (DCPT): đĩ là những vật dụng vứt bỏ ngồi nhà cĩ chứa n−ớc hoặc khơng chứa n−ớc nh−ng cĩ khả năng chứa n−ớc đọng sau cơn m−a nh−: lốp xe, gáo dừa, lon bia, chum vai vỡ ...
2.10. Khía cạnh đạo đức trong nghiên cứu.
- Phải đ−ợc cán bộ y tế và chính quyền của địa ph−ơng chấp nhận.
- Phải thơng báo và giải thích cho các hộ gia đình về mục đích nghiên cứu , các hoạt động và các lợi ích thu đ−ợc cũng nh− các rủi ro của việc cĩ Mesocyclops trong dụng cụ chứa n−ớc và phải đ−ợc sự chấp nhận của ng−ời dân, sẽ khơng bắt buộc nếu nh− gia đình khơng muốn . Theo mẫu cam kết. ( phụ lục 2 )
2.11. Những khĩ khăn
Mesocyclops chỉ thích hợp với các dụng cụ chứa n−ớc lớn nh− bể Unicef, bể xây, chum, vai, giếng hoặc các dụng cụ l−u giữ n−ớc lâu , cịn các dụng cụ chứa n−ớc nhỏ th−ờng xuyên đ−ợc súc rửa hàng ngày và các vật phế thải nh− bát vỡ, vỏ đồ hộp, ..vv..khơng chứa n−ớc th−ờng xuyên nên Mesocyclops khĩ tồn tại và phát triển.
Tập quán thau rửa các DCCN của ng−ời dân đã làm giảm số l−ợng dụng cụ cĩ Mesocyclops cũng nh− l−ợng Mesocyclop trong các dụng cụ chứa n−ớc nhất là với