4.2.1 Dấu hiệu lâm sàng sau khi thử nghiệm xác định liều LD50
Để xác định liều gây bệnh cho chuột, chúng tôi bố trí thí nghiệm và tìm liều gây chết 50% số chuột. Sau 5 ngày theo dõi kết quả được ghi nhận qua bảng 4.3
Bảng 4.3 Kết quả xác định liều LD50 gây chết của Escherichia coli trên chuột bạch Nghiệm thức Mật độ Escheric hia coli
Số liệu thí nghiệm Theo tần số tích lũy Tổng số chuột Số chết Số sống Số chết Số sống Tổng số Tỷ lệ chết (%) (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) I 1x109 12 0 12 0 26 26 0ab II 2,5x109 12 3 9 3 14 17 17,65b III 5x109 12 7 5 10 5 15 66,67c IV 1x1010 12 12 0 22 0 22 100d PD LD50 0,3400652795 2,29 x109
Ghi chú: PD (proportional distance) khoảng cân đối; LD50 là liều gây chết 50% chuột thí nghiệm Các chử số a, b, c, d trong cùng một cột sai khác có ý nghĩa thống kê (p<0,05).
Cột (1), (2), (3) số liệu thí nghiệm
Cột (4) là tổng các trị số của cột (2) tính từ hàng trên cùng đến hàng đó Cột (5) là tổng các trị số của cột (3) tính từ hàng cuối cùng đến hàng đó Cột (6) mỗi hàng là tổng của cột (4) và cột (5) thuộc hàng đó
Cột (7) là tỷ lệ cột (4) so với cột (6)
Ở thí nghiệm 1 (nồng độ vi khuẩn 1x109 cfu/ml) nhận thấy: thân nhiệt chuột tăng lên khoảng 0,5 – 3oC, chuột ăn và uống ít hơn, nằm im, co cụm lại với nhau sau khi gây nhiễm khoảng 8 giờ thấy tiêu phân hơi ướt. Sau ngày đầu tiên, thân nhiệt trở lại gần như mức bình thường. Đến ngày thứ 3 chuột hoạt động nhanh nhẹn và ăn uống bình thường. Qua Bảng 4.2 thì sau 5 ngày theo dõi không ghi nhận được số chuột chết ở nồng độ 108 cfu/ml. Sự sai khác về tỉ lệ chết ở nghiệm thức này so với tỉ lệ chết ở nghiệm thức 2 không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05). Đồng thời so với tỉ lệ chết ở nghiệm thức 3 và 4, sự sai khác này rất có ý nghĩa thống kê (p< 0,01).
Đối với thí nghiệm 2 (nồng độ vi khuẩn 2,5x109 cfu/ml) sau khi gây nhiễm 7 giờ chuột bỏ ăn, uống, hoạt động chậm chạp, thở mạnh và tiêu chảy phân ước, dinh thành dây và có màu vàng, sau khoảng thời gian này bắt đầu ghi nhận được số chuột chết. Tỉ lệ chuột chết là 17,65% số chuột thí nghiệm. Tỉ lệ chuột chết ở nghiệm thức này sai khác so với nghiệm thức 3 có ý nghĩa thống kê (p< 0,05) thể hiện trên Bảng 4.2 và sai khác rất có ý nghĩa so với nghiệm thức 4 (p< 0,01). Thân nhiệt trên các chuột thí nghiệm tăng khoảng 4 – 5oC, nhưng hầu hết giảm trở lại mức gần như bình thường sau khi qua ngày thứ 3, thứ 4.
Đối với nghiệm thức tiêm ở nồng độ 5x109 cfu/ml, ở ngày thứ nhất (cách 6 giờ sau khi tiêm) chuột chết, bỏ ăn uống, nằm co cụm, thở mạnh và tiêu chảy nặng phân sệt màu vàng hoặc xám trên tất cả số chuột thí nghiệm. Tỉ số chuột
chết ở thí nghiệm này là 66,67%. Ở nồng độ 5x109 cfu/ml tỉ lệ chết cao hơn nồng độ 2,5x109 cfu/ml và sự sai khác này sai khác rất có ý nghĩa thống kê. Thân nhiệt các chuột thí nghiệm tăng rất cao khoảng 4 – 7oC, bỏ ăn ở ngày đầu và các ngày sau chuột ăn, uống rất ít. Các chuột chết đều có biểu hiện hô hấp rõ rệt: thở mạnh, tim đập nhanh, biểu hiện khó thở, chạy xung quanh và co giật trước khi chết.
Đối với nồng độ tiêm 1x1010 cfu/ml chuột bắt đầu chết chỉ sau 4 giờ gây nhiễm,chuột chết, bỏ ăn uống, nằm co cụm, thở mạnh và tiêu chảy rất nặng phân lỏng, sệt màu vàng hoặc xám trên tất cả số chuột thí nghiệm ở liều này thì chuột chết 100% sai khác rất có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Ngoài các triệu chứng trên thì sau 30 phút tiêm vi khuẩn thân nhiệt chuột bắt đầu tăng và tăng rất cao khoảng 8 – 9oC.
Qua Bảng 4.2 cho thấy, tỷ lệ chết 50% trên chuột sau khi gây nhiễm
Escherichia coli ở mật độ 2,29x109 cfu/ml. Ở mật độ 1x1010 cfu/ml có tỷ lệ chuột chết 100%, ở mật độ 1x109 cfu/ml không gây chết. Ở mật độ cao gây chết nhanh và cấp tính. Do vi khuẩn Escherichia coli có độc lực. Kết quả này gần giống nghiên cứu của Helma et al. (1996), liều gây chết 50% trên chuột của vi khuẩn Escherichia coli (O18K5) là 2x107. Một nghiên cứu khác của Yousil et al. (2013), xác định liều gây chết 50% của vi khuẩn Escherichia coli
(K99, O157) trên chuột bạch là 1x1010 cfu/ml. Điều này có thể chứng minh là các chủng vi khuẩn có độc lực khác nhau, gây chết chuột thí nghiệm ở mức độ khác nhau.
Dấu hiệu bệnh lý: sau khi gây nhiễm 60 phút, chuột có biểu hiện tiêu chảy, ít hoạt động, xù lông, nằm sát nhau, thân nhiệt giảm. Mức độ tiêu chảy biểu hiện ngày càng nặng hơn. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu David, (2002), triệu chứng của độc tố đường ruột do Escherichia coli gây tiêu chảy trên heo sơ sinh và heo sau cai sữa.
Một số kết quả nghiên cứu khác về kiểm tra độc lực của vi khuẩn
Escherichia coli trên chuột bạch cho thấy, các chủng Escherichia coli có mang gen độc lực gây chết chuột trong các thí nghiệm. Isaacson et al. (2007), khi kiểm tra độc lực của vi khuẩn Escherichia coli và Salmonella aureus cho thấy, độc lực của vi khuẩn Escherichia coli và Salmonella aureus gây chết chuột từ 50 – 100%. Nghiên cứu của Zinnah et al. (2007), triệu chứng sau khi gây nhiễm Escherichia coli trên chuột là gây tiêu chảy sau 10 – 42 giờ. Tỷ lệ chết 100%.
Hình 4.6 Triệu chứng tiêu chảy Hình 4.7 Triệu chứng ủ rũ 4.2.2 Bệnh tích trên chuột khi thử nghiệm xác định liều LD50
Sau 5 ngày theo dõi, đến ngày thứ 6 chúng tôi mổ khám và ghi nhận kết quả được trình bày ở bảng 4.4.
Bảng 4.4 Kết quả mổ khám khi thử liều LD50
Liều gây nhiễm
Bệnh tích 1x109 cfu/ml 2,5x109 cfu/ml 5x109 cfu/ml 1x1010 cfu/ml Số con Tỉ lệ (%) Số con Tỉ lệ (%) Số con Tỉ lệ (%) Số con Tỉ lệ (%) Bụng chứng hơi, dạ dày và ruột nhiều khí.
3 25,00ab 6 50,00bc 8 66,67c 10 83,33d
b
Niêm mạc ruột mỏng, gan sưng tụ huyết và ruột xuất huyết
2 16,67ab 7 58,33bc 9 75,00cd 11 91,67d
Các chữ a, b, c, d trong cùng một dòng sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức 1% (p<0,05).
Kết quả mổ khám nhận thấy:
Ở nồng độ tiêm 1x109 cfu/ml có 25,00% xoang bụng chuột bị chứng hơi, dạ dày và ruột chứa nhiều khí. Tỉ lệ bệnh tích này sai khác có ý nghĩa thống kê (p< 0,05) với 3 nồng độ 2,5x109 cfu/ml với tỉ lệ là 50,00%, nồng độ 5x109 cfu/ml có tỉ lệ là 66,67% và nồng độ 1x1010 cfu/ml có tỉ lệ 83,33% nhưng giữa nồng độ 2,5x109 cfu/ml và 5x109 cfu/ml sai khác không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05) và so với nồng độ 1x1010 thì sự sai khác này rất có ý nghĩa thống kê (p< 0,01) . Như vậy ở nồng độ vi khuẩn cao thì bệnh tích mủ thể hiện chủ yếu ở nội tạng. Về bệnh tích niêm mạc ruột mỏng, gan sưng tụ huyết và ruột xuất huyết, sự sai khác ở 4 nồng độ 1x109 cfu/ml, 2,5x109 cfu/ml, 5x109 cfu/ml và 1x1010 cfu/ml rất có ý nghĩa thống kê (p< 0,01). Ở nồng độ 1x109 cfu/ml và (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
không có ý nghĩa thống kê so với nồng độ 2,5x109 cfu/ml là 58,33%. Nhưng so với nồng độ 5x109 cfu/ml 75,00% sự sai khác này rất có ý nghĩa thống kê (p< 0,01). Qua kết quả trên cho thấy bệnh tích niêm mạc ruột mỏng, gan sưng tụ huyết và ruột xuất huyết thường xuất hiện ở nồng độ 2,5x109 cfu/ml và 5x109 cfu/ml.
Kết quả này phù hợp với nghiên cứu Lê Thị Hoài (2008) kiểm tra độc lực của vi khuẩn Escherichia coli trên chuột bạch, cho thấy đều có bệnh tích là bụng chướng to, gan sưng xuất huyết, ruột xuất huyết.
Hình 4.8 Gan xuất huyết Hình 4.9 Ruột mỏng
Hình 4.10 Dạ dày nhiều khí, mỏng Hình 4.11 Manh tràng mỏng Tái phân lập vi khuẩn
Phân lập vi khuẩn Escherichia coli từ mẫu bệnh phẩm ở ruột và phân chuột chết, trên môi trường TBX (Tryptone bile X- Glucuronide), bằng cách
dùng tăm bông vô trùng phết lên mẫu bệnh phẩm, cấy lên môi trường, ủ 37oC
trong 24 giờ. Kết quả xuất hiện khuẩn lạc tròn, bóng, lồi, màu xanh trên môi trường đặc trưng TBX, chứng tỏ có sự hiện diện của vi khuẩn Escherichia coli gây tiêu chảy trong ruột và phân. Như vậy kết quả xác định chuột chết do vi khuẩn Escherichia coli (Hình 4.13).
Hình 4.12 Vi khuẩn Escherichia coli trên môi trường TBX từ
phân
Hình 4.13 Vi khuẩn Escherichia coli được phân lập từ ruột, dạ dày,
gan, thận
Gan Dạ dày
Ruột
CHƯƠNG 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận
Qua thời gian thưc hiện đề tài chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
Khi tiêm vi khuẩn Staphylococcus aureus và Escherichia coli vào thì thân nhiệt tăng, bỏ ăn uống, hoạt động kém, chạy xung quanh và co giật trước khi chết.
Vi khuẩn Staphylococcus aureus gây chết 50% số chuột thí nghiệm ở nồng độ 3,74x109 cfu/ml. Sau 5 ngày theo dõi thì có các bệnh tích đặc trưng ở các nồng độ từ thấp lên cao 108 cfu/ml, 109 cfu/mlvà 1010 cfu/ml có tỉ lệ là 16,67%, 77,78%, 75,00% bị tích mủ ở gan, thận, lách, ruột, dạ dày và xoang bụng; Hoại tử vùng tiêm thì ở nồng độ 108 không có, 109 cfu/ml là 11,11% và 1010 cfu/ml là 75,00%. Gan thận sưng và nhạt màu, lách sưng có tỉ lệ 25,00%, 77,78%, 100%.
Vi khuẩn Escherichia coli gây chết 50% số chuột thí nghiệm ở nồng độ 2,29x109 cfu/ml. Bệnh tích đặc trưng của vi khuẩn này sau khi gây nhiễm là bụng chứng hơi, dạ dày và ruột nhiều khí ở các nồng độ từ thấp lên cao 1x109 cfu/ml, 2,5x109 cfu/ml, 5x109 cfu/ml, 1x1010 cfu/ml có tỉ lệ, 25,00%, 50,00%, 66,67% và 83,33%. Niêm mạc mỏng gan sưng tụ huyết và ruột xuất huyết có tỉ lệ lần lược là; 16,67%, 58,33%, 75,00% và 91,67%.
5.2 Đề nghị
Do thời gian và kinh phí thực hiện đề tài có hạn, nên chưa tiến hành nghiên cứu sâu hơn về các gen độc tố của vi khuẩn. Đề nghị thực hiện thêm nghiên cứu này trên các động vật khác như: heo, thỏ, gà…
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
Bùi Thị Tho, 2003. Thuốc kháng sinh và nguyên tắc sử dụng trong chăn nuôi. NXB Hà Nội, trang 54-66.
Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên, Đỗ Ngọc Thúy, Nguyễn Xuân Hiên, Âu Xuân Tuấn, Văn Thị Hường, Đào Thị Hảo và Vũ Ngọc Quý, 2003. Kết quả điều tra tình hình tiêu chảy của heo con theo mẹ tại một số trại heo miền bắc Việt Nam, xác định tỷ lệ kháng kháng sinh và các yếu tố gây bệnh cuả các chủng Escherichia coli
phân lập được. Báo cáo khoa học chăn nuôi Thú y, phần Thú y. NXB Nông Nghiệp Hà Nội, trang 106-118.
Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phượng, Lê Ngọc Mỹ và Huỳnh Văn Khang, 1999. Đỗ Kháng, 2005. “Bổ sung một trong những sản phẩm sinh học hoặc thảo dược để ức chế sự phát triển của vi khuẩn và tăng sức đề kháng của heo con”. Báo nông nghiệp, số 119, ngày 16/6/2005.
Lê Văn Tạo, Nguyễn Ngũ, Nguyễn Thiên Thu, Đặng Văn Tuấn, 2003. Độc lực và một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Escherichia coli phân lập từ bê tiêu chảy tại các tỉnh Nam trung bộ, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú Y, tập X, (số 3).
Lê Văn Tạo, 2006. Bệnh do vi khuẩn Escherichia coli gây ra ở lợn. Khoa học kỹ thuật Thú y, tập XIII, Số 3, trang 75-84.
Lê Huy Chính, Vi Sinh Vật Y Học, NXB Y Học Hà Nội, pp. 143 – 152. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lý Thị Liên Khai, Phạm Quốc Vượng, Hideki Kobayashi, Trần Thị Phận, Châu Bá Lộc, Seishi Yamasaki và Toshiaki Taniguchi, 2003. Phân lập định danh và điều trị bệnh tiêu chảy cho heo con gây ra do Enterotoxigenic Escherichia coli K88, K99, 987P ở tỉnh Cần Thơ. Tạp chí khoa học Đại Học Cần Thơ, Chuyên ngành: Chăn nuôi và Thú y, trang 124-129.
Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 1997. Vi sinh vật Thú y. NXB Nông Nghiệp, pp. 5 - 11, 80 - 85.
Nguyễn Vĩnh Phước, 1977. Vi sinh vật học Thú y. Tập 2, NXB Đại học và THCN Hà Nội, pp. 3 – 11, 133 – 140.
Nguyễn Văn Biện, 2001, Bệnh Chó Mèo, NXB Trẻ, pp. 81 – 90.
Phạm Hồng Sơn, Nguyễn Thị Thanh, Phan Văn Chinh và Phạm Quang Trung (2002), “Vi sinh vật Thú y”, NXB Nông nghiệp Hà Nội, tr. 10 – 14.
Trương Quang, 2005. Kết quả nghiên cứu vai trò gây bệnh của Escherichia coli trong hội chứng tiêu chảy ở lợn 1 - 60 ngày tuổi, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập XII, (số 1), tr 27 -32.
Tô Minh Châu, Trần Thị Bích Liên, 2001, Vi Khuẩn Và Nấm Gây Bệnh Trong Thú y, pp. 1 – 6.
Võ Thành Thìn, Lê Đình Hải, Vũ Khắc Hùng, 2010. Khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn Escherichia coli phân lập từ lợn con mắc bệnh tiêu chảy. Khoa học kỹ thuật Thú y. Tập XVIII, Số 5, 2010, trang 5-10.
Alexander, T. J. L., 1994. Chapter 7: Neonatal Diarrhea in pigs. Part II: Diseases caused by Escherichia coli. Escherichia coli in Domestic Animals and Humans. pp: 151-170.
Bertschinger, H. U., 1992. Introduction, chapter 39: Escherichia coli
infections. Diseases of swine. 6th Edition, pp: 487-488.
Fairbrother, J. M., 1992. Enteric colibacillosis. Chapter 39: Escherichia coli
infections. Diseases of swine. Edition, pp: 489-497
Fairbrother J.M., Nadeau E., and Gyles C.L., 2005. Escherichia coli in postweaning diahrroea in pigs: an update on bacterial types, pathogenesis and prevention strategies, Animal health Res., 6, pp. 17-39.
Fairbrother J.M., and Gyles C.L., 2006, “Escherichia coli infection”, In: Disease of swine (9th edition). Editor: Straw, B.E., Jimmerman, J.J., D’Allaire, S., Taylor, D.T., Blackwell publishing, pp. 639-662.
Fujii Y., Hayashi M., Hitotsubashi S., Fuke Y., Yamanaka H. and Okamoto K., 1991, “Purification and characterization of Escherichia coli heat-stable enterotoxin II”, J. Bacteriol., 173, pp. 5516-5522.
Guinee P.A.M, and Jansen W.H., 1979, “Behavior of Escherichia coli K antigen K88ab, K88ac and K88ad in immunoelectroporesis, double diffution and haemaglutination”, Infect. Immune., 23, pp. 700-705.
Gyles C.L., 1994, “Escherichia coli enterotoxin. In: Escherichia coli in domestic animals and human”, Editor: Gyles, C.L. CBA international,
Wallingford, Oxon, UK, pp. 337-364.
Gyles C.L., Fairbrother J.M., 2010, “Escherichia coli”, In: Pathogenesis of bacterial infections in animal (4th edition). Editor: Gyles, C.L., Prescott, J.F., Songer, J.G., and Thoen, C.O., Blackwell publishing, USA, pp. 267-308.
Hirsh D.C., 2004, “Enterobacteriaceae: Escherichia”, In: Veterinary microbiology. Editor: Hirsh, D.C., MacLachlan, and Walker, R.L. Blackwell publishing, USA, pp. 61-68.
Hitotsubashi S., Fujii Y., Yamanaka H. And Okamoto K., 1992. Some properties of purified Escherichia coli heat-stable enterotoxin II. Infect. Immun., 60, pp. 4468 – 4478.
IsaacSon, R. E., Nagy, B. & Moon, H. W., 1977. Colonization of porcine small intestine by Escherichia coli: Colonization and adhesion factors of pig enteropathogens that lack K88, Journal of Infectious Diseases 135, 531-539.
Janetx, Melnick & Adelberg’s, 2001, Medical Microbiology, Lange Medical Books/Megrow-Hill, Medical Publishing Divison, pp. 197 – 202, 217 – 228.
Jacobs A.A., Simons B.H., De Graaf F.K., 1987. The role of lysine-132 and arginine-136 in the receptor-binding domain of the K99 fibrillar subunit, EMBO J., 6(6), p.1805-1808.
Konowalchuk, J., Speirs, J. I. & Stavric , S. 1977. Vero response to a cytotoxin of Escherichia coli , Infection and Immunity 18, 775-779.
Levine, M. M., 1987. “Escherichia coli that cause diarrhea: enterotoxin, enteropathogenic, enteroinvasive, enterohemorrhagic and enteroadherent”. Journal of Infectious Diseases 155: 377-389.
Madigan M.T., and Martinko J.M., 2006, “Brock biology of microorganisms (11th edition)”. Pearson Prentice Hall, Inc.Upper Saddle Rever, New Jersey, pp. 79- 85.
Mol O., and Oudega B., 1996, “Molecular and structural aspects of fimbriae biosynthesis and assembly in Escherichia coli”, FEMS Micro. Rev., 19, pp. 25-52.
Nagy B., Cacey T.A., Whip S.C., Moon H.W., 1992. “Susceptibility of porcine intestine to pilus-mediated adhesion by some isolated of piliated of enterotoxigenic (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Escherichia coli increase with age”, Infect. Immun., 60, pp. 1285-1294
Nagy, B. and Fekete, P. Z., 1999. Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) in farm. Vet. Res 30, pp. 259-284.
Nagy, B. et al., 1978. Immunization of suckling pigs enteric enterotoxigenic
Escherichia coli infection by vaccinating dams with purified pili. Infection. and Immun. 21: 269-274.
Nataro J.P., and Kaper J.B., 1998. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin. Microbiol, Rev, 11(1), pp. 142-201.
Orskov, F., 1978. Vilurence Factor of the bacterial cell surface, J. Infect., P. 630.
Orskov I., Orskov F., Sojka W.J., Leach J.M., 1961. “Simultaneous occurrence of Escherichia coli B and Lantigens in strains from diseased swine. Influence of