Triệu chứng
Tiêu chảy do vi khuẩn Escherichia coli phụ thuộc vào yếu tố độc lực của vi khuẩn Escherichia coli và tuổi cũng như tình trạng miễn dịch của heo con. Có trường hợp bệnh diễn ra nhanh và chết trước khi có triệu chứng tiêu chảy (Fairbrother, 1992).
Bệnh tiêu chảy do vi khuẩn Escherichia coli xảy ra đối với heo theo mẹ và sau cai sữa, thường xảy ra ở heo con vừa cai sữa. Mức độ tiêu chảy tùy thuộc vào độc lực của vi khuẩn và độ tuổi của heo. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn ở heo sau cai sữa cũng rất cao nhưng do heo dễ chăm sóc nên heo có thể qua khỏi, tỷ lệ heo mắc bệnh chết giảm. Heo nhiễm bệnh có thể xuất hiện riêng lẽ từng cá thể hoặc cả đàn. Heo tiêu chảy phân màu vàng hoặc hơi nâu, tiêu chảy thường xuất hiện 3 – 5 ngày ở heo cai sữa và có thể kéo dài hàng tuần. Heo có biểu hiện còi cọc, chậm lớn, lông xù, da nhăn nheo, mắt trũng sâu. Trong trường hợp tiêu chảy nặng, trọng lượng cơ thể có thể giảm 30 – 40 %. Hệ thống cơ vùng xoang bụng nhão và mất trương lực. Tỷ lệ heo mắc bệnh chết có thể đến 70% (Gyles and Fairbrother, 2010).
Bệnh tích
Bệnh tích đại thể có thể thấy được là heo con bị mất nước nặng. Bệnh tích đặc trưng ở heo sau cai sữa là các tĩnh mạch trên đường cong lớn dạ dày bị nhồi huyết, ruột non dãn nở, thành ruột non xuất huyết. Một số trường hợp thấy xuất huyết thành dạ dày, chất chứa trong ruột có màu nâu (Gyles and Fairbrother, 2010).
Bệnh tích vi thể đường tiêu hóa tùy thuộc vào độc lực của chủng vi khuẩn gây bệnh. Heo nhiễm các chủng ETEC thường có biểu hiện xuất huyết tĩnh mạch màng treo ruột, thỉnh thoảng có xuất huyết trong lòng ruột, bạch cầu
trung tính và đại thực bào tăng trong hạch màng treo ruột và chuyển vào trong lòng ruột. Hệ thống lông nhung có thể bị bong tróc và hoại tử hoặc tập trung thành từng đám. Khi quan sát tiêu bản màng nhầy ruột non dưới kính hiển vi điện tử thấy vi khuẩn gắn chặt với các tế bào biểu mô ruột và cạnh các vi lông nhung. Trong trường hợp bệnh nặng, các lông nhung biến mất và xuất hiện các sợi tơ huyết làm tắt các vi tĩnh mạch ở màng treo ruột, dạ dày, ruột non và kết tràng (Gyles and Fairbrother, 2010).
CHƯƠNG 3
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu
3.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian thực hiện: đề tài được thực hiện từ tháng 07/2012 đến tháng 11/2013.
Địa điểm thực hiện
Phòng thí nghiệm Dược lý, bộ môn Thú y, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng - Trường Đại Học Cần Thơ.
3.1.2 Đối tượng thí nghiệm
Các chủng vi khuẩn Staphyloccus aureus và Escherichia coli được lưu trữ tại phòng thí nghiệm vệ sinh thực phẩm, bộ môn Thú y, khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng Dụng – Trường Đại Học Cần Thơ.
3.2 Phương tiện nghiên cứu
3.2.1 Dụng cụ, trang thiết bị thí nghiệm
Tủ sấy dụng cụ (Classware drying oven), tủ ấm (Incubator), autoclave, máy ly tâm, máy lắc, buồng cấy vô trùng, cân, dao, kéo, đĩa petri, kim tiêm, lồng nuôi chuột thí nghiệm, chai nước uống cho chuột, ống nghiệm, ống đong, ống hút, chai, que cấy, đèn cồn, nhiệt kế, túi nylon một số dụng cụ khác.
3.2.2 Hóa chất
Hóa chất: dung môi DMSO, nước sinh lý, nước cất, môi trường MHA (Muller Hinton agar), BP (Baird-Parker), cồn 70oC, cồn 90oC, BaCl2.2H2O, H2SO4.
3.2.3 Động vật thí nghiệm
Động vật thí nghiệm: Chuột bạch (Mus musculus domesticus) giống ddY
(Nhật Bản) sạch bệnh.
Tuổi: Từ 6 – 8 tuần tuổi.
Trọng lượng trung bình mỗi chuột: 25 – 30 gram. Nơi cung cấp: Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh.
3.3 Phương pháp tiến hành thí nghiệm 3.3.1 Nuôi chuột 3.3.1 Nuôi chuột
Chuột bạch sau khi mua về được nuôi trong hộp nhựa hình chữ nhật. Mỗi hộp lót độn bằng trấu được sát trùng cẩn thận có chứa thức ăn và nước uống riêng. Nước uống được đựng trong chai nhựa có nắp đậy. Chuột nuôi được cho ăn với khẩu phần khoảng 5 g/ngày, mỗi ngày cho ăn một hoặc hai lần với loại thức ăn viên dành riêng cho chuột. Tất cả chuột thí nghiệm được nuôi dưỡng và chăm sóc trong cùng điều kiện.
3.3.2 Xác định liều gây chết 50% (LD50) ở chuột thí nghiệm
Thí nghiệm LD50 được tiến hành nhằm xác định độc lực của vi khuẩn có khả năng gây chết 50% ở chuột thí nghiệm.
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên (bảng 3.3), 1 nhân tố với 4 mức độ gây nhiễm đối với Staphylococcus aureus là (NT1: 108 cfu/ml; NT2: 109 cfu/ml; NT3: 1010 cfu/ml; NT4: 1011 cfu/ml) và
Escherichia coli là (NT1: 1x109 cfu/ml; NT2: 2,5x109 cfu/ml; NT3: 5x109 cfu/ml, NT4: 1x1010 cfu/ml), 3 lần lập lại, 12 đơn vị thí nghiệm.
Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm xác định liều gây chết 50% (LD50)
Nghiệm thức Lặp lại NT1 NT2 NT3 NT4 1 4 4 4 4 2 4 4 4 4 3 4 4 4 4
Phương pháp tiến hành: gây nhiễm trên chuột bạch bằng cách tiêm xoang bụng, với thể tích tiêm 1 ml ở từng nghiệm thức.
Vi khuẩn Staphyloccoccus aureus và Escherichia coli sau nuôi cấy tăng sinh trên môi trường NA ở 37oC trong 24 giờ, sau đó được chuyển vào môi trường PBS (pH= 7,4) để nuôi tăng sinh trong 4 giờ, trong quá trình nuôi cấy có lắc kích thích tăng sinh của vi khuẩn. Lấy 2 ml dung dịch trên đem ly tâm ở 10.000 vòng/phút ở 4oC trong 10 phút. Phần dung dịch nổi bên trên sau khi ly tâm được bỏ đi, phần lắng phía đáy được rửa 2 lần với dung dịch Ringer’s solution. Phần vi khuẩn lắng phía dưới sẽ được pha loãng với dung dịch Ringer’s solution đến khi đạt nồng độ 1011 cfu/ml theo tiêu chuẩn McFarland Standard (kiểm tra lại mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ với bước sóng 600 nm, điều chỉnh OD-1±0,1). Pha loãng dung dịch vi khuẩn 10 lần để được các mật độ 1010 cfu/ml, 109 cfu/ml, 108 cfu/ml (Liben et al., 2012).
Thời gian theo dõi sau khi gây cảm nhiễm là 5 ngày. Sau khi gây nhiễm theo dõi dấu hiệu bệnh lý, số chuột chết. Tiến hành phân lập và nuôi cấy vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm (tim, phổi, gan, thận, lách) ở những chuột chết trong khoảng 1 – 2 ngày. Cắt nhỏ mẫu cơ quan phủ tạng hòa tan trong dung dịch nước muối sinh lý. Chan đĩa trên môi trường chuyên biệt để xác định nguyên nhân gây chết của chuột. Sau 5 ngày theo dõi, đến ngày thứ 6 tiến hành mổ khám để ghi nhận dấu hiệu bệnh tích trên chuột.
Phương pháp tính LD50 dựa theo Reed-Muench (1938).
Tỷ lệ nhiễm chết thấp nhất >50% - 50% PD =
Tỷ lệ nhiễm chết thấp nhất> 50% - Tỷ lệ nhiễm chết cao nhất < 50% LD50= 10(lũy thừa của nồng độ gây chết trên 50% nhỏ nhất - PD)
Ghi chú: PD (proportional distance) khoảng cân đối; LD50 là liều gây chết 50% động vật thí nghiệm
3.4 Chỉ tiêu theo dõi -Tỉ lệ chuột chết -Tỉ lệ chuột chết
- Dấu hiệu lâm sàng, nhiệt độ - Bệnh tích
3.5 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý thống kê theo phương pháp Chi-square bởi phần mềm Minitab 16.0, Chi square Yates và Fixer Exactly Test bởi phần mềm Excel 2003.
CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả thử nghiệm LD50 của chủng Staphylococcusaureus trên chuột 4.1.1 Dấu hiệu lâm sàng sau khi thử nghiệm xác định liều LD50 4.1.1 Dấu hiệu lâm sàng sau khi thử nghiệm xác định liều LD50
Để xác định liều gây bệnh cho chuột, chúng tôi bố trí thí nghiệm và tìm liều gây chết 50% số chuột. Sau 5 ngày theo dõi kết quả được ghi nhận qua bảng 4.1.
Bảng 4.1 Kết quả thử nghiệm liều LD50 trên chuột
Nghiệm thức Mật độ Staphyloc occus aureus
Số liệu thí nghiệm Theo tần số tích lũy Tổng số chuột Số chết Số sống Số chết Số sống Tổng số Tỷ lệ chết (%) (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) I 108 12 0 12 0 25 25 0ab II 109 12 3 9 3 13 16 18,75b III 1010 12 8 4 11 4 15 73,33c IV 1011 12 12 0 23 0 23 100d PD LD50 0,4274459509 3,74 x 109
Ghi chú: PD (proportional distance) khoảng cân đối; LD50 là liều gây chết 50% chuột thí nghiệm Các chử số a, b, c, d trong cùng một cột sai khác có ý nghĩa thống kê (p<0,05).
Cột (1), (2), (3) số liệu thí nghiệm
Cột (4) là tổng các trị số của cột (2) tính từ hàng trên cùng đến hàng đó Cột (5) là tổng các trị số của cột (3) tính từ hàng cuối cùng đến hàng đó Cột (6) mỗi hàng là tổng của cột (4) và cột (5) thuộc hàng đó
Cột (7) là tỷ lệ cột (4) so với cột (6)
Ở nghiệm thức 1 (nồng độ vi khuẩn 108 cfu/ml) nhận thấy: thân nhiệt chuột tăng lên khoảng 1 – 3oC, chuột nằm im, thở nhanh hơn bình thường, ăn uống ít hơn và co cụm lại với nhau sau khi gây nhiễm khoảng 7 giờ. Sau ngày đầu tiên, thân nhiệt trở lại gần như mức bình thường. Đến ngày thứ 3 chuột hoạt động nhanh nhẹn và ăn uống bình thường. Qua Bảng 4.1 thì thấy, sau 5 ngày theo dõi không ghi nhận được số chuột chết ở nồng độ 108 cfu/ml. Sự sai khác về tỉ lệ chết ở nghiệm thức này so với tỉ lệ chết ở nghiệm thức 2 không có ý nghĩa thống kê. Và so với tỉ lệ chết ở nghiệm thức 3 và 4, sự sai khác này rất có ý nghĩa thống kê (p< 0,01).
Đối với thí nghiệm 2 (nồng độ vi khuẩn 109 cfu/ml) sau khi gây nhiễm 5 giờ thì tất cả chuột ở nghiệm thức này đều hoạt động chậm chạp, bỏ ăn uống, thở mạnh và có biểu hiện khó thở, sau khoảng thời gian này bắt đầu ghi nhận được số chuột chết. Qua Bảng 4.1 cho thấy, tỉ lệ chuột chết là 18,75% số chuột
thí nghiệm. Tỉ lệ chuột chết ở nghiệm thức này sai khác so với nghiệm thức 3 là có ý nghĩa thống kê (p< 0,05) và sai khác rất có ý nghĩa so với nghiệm thức 4 (p< 0,01). Thân nhiệt trên các chuột thí nghiệm tăng khoảng 4 – 5oC, nhưng hầu hết giảm trở lại mức gần như bình thường sau khi qua ngày thứ 3.
Đối với nghiệm thức 3 tiêm chuột ở nồng độ vi khuẩn là 1010 cfu/ml, ở ngày thứ nhất khi tiêm sau 4 giờ chuột bỏ ăn uống, thở mạnh và nằm co cụm trên tất cả số chuột thí nghiệm. Tỉ lệ chuột chết ở thí nghiệm này là 73,33%. Ở nồng độ 1010 cfu/ml tỉ lệ chết cao hơn nồng độ 109 cfu/ml và sự sai khác này sai khác rất có ý nghĩa thống kê ( p< 0,01) thể hiện trên Bảng 4.1. Chuột bỏ ăn ở ngày đầu và các ngày sau chuột ăn, uống rất ít và thân nhiệt tăng rất cao khoảng 5 – 7oC trên tất cả chuột thí nghiệm. Ở nghiệm thức này các chuột chết đều có biểu hiện hô hấp rất rõ là thở mạnh, lồng ngực ốp lại, tim đập nhanh, biểu hiện khó thở, chạy xung quanh và co giật trước khi chết.
Đối với nghiệm thức 4 tiêm ở nồng độ 1011 cfu/ml chuột bắt đầu chết sau 2 giờ gây nhiễm, ở nghiệm thức này chuột chết 100% và sai khác rất có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại ( p< 0,01). Ở nồng độ này sau 30 phút tiêm vi khuẩn thì thân nhiệt chuột bắt đầu tăng và tăng rất cao khoảng 8 – 9 oC. Còn các triệu chứng khác thì giống như ở nồng độ 1010 cfu/ml.
Như vậy, gây bệnh với chủng Staphylococcus aureus, chuột thí nghiệm chỉ tập trung chết vào ngày thứ 1, thứ 2 các ngày còn lại tuy hoạt động, ăn uống kém nhưng không ghi nhận được số chết. Một số chuột đi phân tiêu chảy nhưng hầu hết phân ở mức bình thường. Đồng thời biểu hiện triệu chứng đặc trưng ở chuột trên tất cả các lô thí nghiệm là hô hấp mạnh, sâu (ốp lồng ngực), tim đập nhanh, chuột chạy xung quanh lồng thí nghiệm trước khi chết và có biểu hiện nghẹt thở và co giật. Triệu chứng này phù hợp với nhận định của Quinton et al. (2011) khi thử nghiệm liều LD50 trên chuột biểu hiện lâm sàng chủ yếu là chuột khó thở, tim đập nhanh. Thân nhiệt tăng cao (tùy thuộc nồng độ) và trong khoảng từ 2 – 3 ngày sau, thân nhiệt chuột ở các lô thí nghiệm trở lại gần như bình thường.
Trong suốt quá trình theo dõi, tất cả chuột chết trong thí nghiệm chúng tôi mổ khám ngay và nhận thấy chủ yếu phổi, tim bị xuất huyết. Sau đó chúng tôi lấy bệnh phẩm (gan, thận, lách, tim, phổi) và nuôi cấy trên môi trường
Baird-Parker. Theo Rosamund et al. (1995) nhận dạng khuẩn lạc
Staphylococcus aureus trên môi trường Baird-Parker tạo khuẩn lạc điển hình có màu đen hoặc xám bóng và lồi, có một vòng trắng đục tiếp giáp với khuẩn lạc. Từ đó chúng tôi xác định được nguyên nhân gây chết chuột là do chủng
nhận thấy: trên gan mật độ vi khuẩn dày đặc, phải qua 2 lần cấy chuyển chúng tôi mới thấy được khuẩn lạc rời. Kế đó là thận, mật độ khá dày nhưng có thể thấy được khuẩn lạc rời. Trên lách số lượng khuẩn lạc tương đối nhiều và phổi có khoảng hơn chục khuẩn lạc. Chỉ có một vài khuẩn lạc đối với mẫu tim. Như vậy, khi gây bệnh trên chuột với vi khuẩn Staphylococcus aureus khi đó vi khuẩn chủ yếu đi đến gan, thận, lách và phổi.
Hình 4.1 Khuẩn lạc Staphylococcus aureus được phân lập từ gan sau 2 lần cấy chuyển
Hình 4.2 Khuẩn lạc Staphylococcus aureus được phân lập từ thận và lách
Hình 4.3 Khuẩn lạc Staphylococcusaureus được phân lập từ phổi và tim
Phổi Tim Thận Lách Gan Gan Gan
4.1.2 Bệnh tích trên chuột khi thử nghiệm xác định liều LD50
Sau 5 ngày theo dõi, đến ngày thứ 6 chúng tôi mổ khám và ghi nhận kết quả được trình bày ở bảng 4.2.
Bảng 4.2 Kết quả mổ khám khi thử liều LD50
Liều gây nhiễm
Bệnh tích
108 cfu/ml 109 cfu/ml 1010 cfu/ml ĐC Số con Tỉ lệ (%) Số con Tỉ lệ (%) Số con Tỉ lệ (%) Số con Tỉ lệ (%) Tích mủ ở gan, thận, lách, ruột, dạ dày và xoang bụng 2 16,67ac 7 77,78bc 3 75,00c 0 0,0 Tích mủ dưới da 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 Hoại tử vùng tiêm 0 0,0ab 1 11,11bc 3 75,00c 0 0,0 Gan, thận sưng và nhạt màu, lách sưng 3 25,00a 7 77,78bc 4 100c 0 0,0 Không có bệnh tích mủ 10 83,33a 0 0,0b 0 0,0c 18 100a
Các chữ a, b, c trong cùng một dòng sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức 1% (p<0,05).
Kết quả mổ khám nhận thấy:
Ở nồng độ tiêm 108 cfu/ml có 16,67% chuột tích mủ trong số các cơ quan gan, thận, lách, ruột, dạ dày và xoang bụng. Qua Bảng 4.2 cho thấy, bệnh tích này sai khác có ý nghĩa thống kê (p< 0,05) với nồng độ 109 cfu/ml với tỉ lệ là 77,78% và nồng độ 1010 cfu/ml có tỉ lệ là 75,00%, nhưng giữa nồng độ 109 cfu/ml và 1010 cfu/ml sai khác không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05). Như vậy ở nồng độ vi khuẩn cao thì bệnh tích mủ thể hiện chủ yếu ở nội tạng. Thí nghiệm này không có chuột có bệnh tích mủ dưới da. Về bệnh tích hoại tử ở ngay vùng tiêm, sự sai khác ở 3 nồng độ 108 cfu/ml, 109 cfu/ml và 1010 cfu/ml có ý nghĩa thống kê (p< 0,05). Ở nồng độ 108 cfu/ml không ghi nhận được bệnh tích này và sự sai khác này không có ý nghĩa thống kê so với nồng độ 109 cfu/ml (p> 0,05). Nhưng so với nồng độ 1010 cfu/ml có tỉ lệ 73,00% và sự sai khác này rất có ý nghĩa thống kê (p< 0,01). Qua kết quả trên cho thấy bệnh tích hoại tử thường xuất hiện ở nồng độ 109 cfu/ml và 1010 cfu/ml. Về bệnh tích gan thận sưng nhạt màu và lách sưng, sự sai khác có ý nghĩa (p< 0,05) giữa 3 nồng độ 108 cfu/ml, 109 cfu/ml và 1010 cfu/ml. Sự sai khác có ý nghĩa 5% giữa nồng độ 108 cfu/ml (25,00%) và nồng độ 109 cfu/ml (77,78%). Và so với nồng độ 1010 cfu/ml thì cũng sai khác có ý nghĩa thống kê (p< 0,05). Giữa 2 nồng độ 109 cfu/ml và 1010 cfu/ml sai khác không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05). Như vậy mật độ vi khuẩn cao ảnh hưởng chủ yếu đến các cơ quan gan, thận, lách. Những chuột không có bệnh tích mủ và nội tạng bình thường, chỉ có ở nồng độ 108 cfu/ml và nghiệm thức đối chứng. Sự sai khác về số chuột
không có bệnh tích mủ giữa 3 nghiệm thức 108 cfu/ml, 109 cfu/ml và 1010 cfu/ml rất có ý nghĩa thống kê (p< 0,01) những giữa nồng độ 108 cfu/ml và đối chứng sai khác không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05). Như vậy khi gây nhiễm ở