Để xác định liều gây bệnh cho chuột, chúng tôi bố trí thí nghiệm và tìm liều gây chết 50% số chuột. Sau 5 ngày theo dõi kết quả được ghi nhận qua bảng 4.1.
Bảng 4.1 Kết quả thử nghiệm liều LD50 trên chuột
Nghiệm thức Mật độ Staphyloc occus aureus
Số liệu thí nghiệm Theo tần số tích lũy Tổng số chuột Số chết Số sống Số chết Số sống Tổng số Tỷ lệ chết (%) (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) I 108 12 0 12 0 25 25 0ab II 109 12 3 9 3 13 16 18,75b III 1010 12 8 4 11 4 15 73,33c IV 1011 12 12 0 23 0 23 100d PD LD50 0,4274459509 3,74 x 109
Ghi chú: PD (proportional distance) khoảng cân đối; LD50 là liều gây chết 50% chuột thí nghiệm Các chử số a, b, c, d trong cùng một cột sai khác có ý nghĩa thống kê (p<0,05).
Cột (1), (2), (3) số liệu thí nghiệm
Cột (4) là tổng các trị số của cột (2) tính từ hàng trên cùng đến hàng đó Cột (5) là tổng các trị số của cột (3) tính từ hàng cuối cùng đến hàng đó Cột (6) mỗi hàng là tổng của cột (4) và cột (5) thuộc hàng đó
Cột (7) là tỷ lệ cột (4) so với cột (6)
Ở nghiệm thức 1 (nồng độ vi khuẩn 108 cfu/ml) nhận thấy: thân nhiệt chuột tăng lên khoảng 1 – 3oC, chuột nằm im, thở nhanh hơn bình thường, ăn uống ít hơn và co cụm lại với nhau sau khi gây nhiễm khoảng 7 giờ. Sau ngày đầu tiên, thân nhiệt trở lại gần như mức bình thường. Đến ngày thứ 3 chuột hoạt động nhanh nhẹn và ăn uống bình thường. Qua Bảng 4.1 thì thấy, sau 5 ngày theo dõi không ghi nhận được số chuột chết ở nồng độ 108 cfu/ml. Sự sai khác về tỉ lệ chết ở nghiệm thức này so với tỉ lệ chết ở nghiệm thức 2 không có ý nghĩa thống kê. Và so với tỉ lệ chết ở nghiệm thức 3 và 4, sự sai khác này rất có ý nghĩa thống kê (p< 0,01).
Đối với thí nghiệm 2 (nồng độ vi khuẩn 109 cfu/ml) sau khi gây nhiễm 5 giờ thì tất cả chuột ở nghiệm thức này đều hoạt động chậm chạp, bỏ ăn uống, thở mạnh và có biểu hiện khó thở, sau khoảng thời gian này bắt đầu ghi nhận được số chuột chết. Qua Bảng 4.1 cho thấy, tỉ lệ chuột chết là 18,75% số chuột
thí nghiệm. Tỉ lệ chuột chết ở nghiệm thức này sai khác so với nghiệm thức 3 là có ý nghĩa thống kê (p< 0,05) và sai khác rất có ý nghĩa so với nghiệm thức 4 (p< 0,01). Thân nhiệt trên các chuột thí nghiệm tăng khoảng 4 – 5oC, nhưng hầu hết giảm trở lại mức gần như bình thường sau khi qua ngày thứ 3.
Đối với nghiệm thức 3 tiêm chuột ở nồng độ vi khuẩn là 1010 cfu/ml, ở ngày thứ nhất khi tiêm sau 4 giờ chuột bỏ ăn uống, thở mạnh và nằm co cụm trên tất cả số chuột thí nghiệm. Tỉ lệ chuột chết ở thí nghiệm này là 73,33%. Ở nồng độ 1010 cfu/ml tỉ lệ chết cao hơn nồng độ 109 cfu/ml và sự sai khác này sai khác rất có ý nghĩa thống kê ( p< 0,01) thể hiện trên Bảng 4.1. Chuột bỏ ăn ở ngày đầu và các ngày sau chuột ăn, uống rất ít và thân nhiệt tăng rất cao khoảng 5 – 7oC trên tất cả chuột thí nghiệm. Ở nghiệm thức này các chuột chết đều có biểu hiện hô hấp rất rõ là thở mạnh, lồng ngực ốp lại, tim đập nhanh, biểu hiện khó thở, chạy xung quanh và co giật trước khi chết.
Đối với nghiệm thức 4 tiêm ở nồng độ 1011 cfu/ml chuột bắt đầu chết sau 2 giờ gây nhiễm, ở nghiệm thức này chuột chết 100% và sai khác rất có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại ( p< 0,01). Ở nồng độ này sau 30 phút tiêm vi khuẩn thì thân nhiệt chuột bắt đầu tăng và tăng rất cao khoảng 8 – 9 oC. Còn các triệu chứng khác thì giống như ở nồng độ 1010 cfu/ml.
Như vậy, gây bệnh với chủng Staphylococcus aureus, chuột thí nghiệm chỉ tập trung chết vào ngày thứ 1, thứ 2 các ngày còn lại tuy hoạt động, ăn uống kém nhưng không ghi nhận được số chết. Một số chuột đi phân tiêu chảy nhưng hầu hết phân ở mức bình thường. Đồng thời biểu hiện triệu chứng đặc trưng ở chuột trên tất cả các lô thí nghiệm là hô hấp mạnh, sâu (ốp lồng ngực), tim đập nhanh, chuột chạy xung quanh lồng thí nghiệm trước khi chết và có biểu hiện nghẹt thở và co giật. Triệu chứng này phù hợp với nhận định của Quinton et al. (2011) khi thử nghiệm liều LD50 trên chuột biểu hiện lâm sàng chủ yếu là chuột khó thở, tim đập nhanh. Thân nhiệt tăng cao (tùy thuộc nồng độ) và trong khoảng từ 2 – 3 ngày sau, thân nhiệt chuột ở các lô thí nghiệm trở lại gần như bình thường.
Trong suốt quá trình theo dõi, tất cả chuột chết trong thí nghiệm chúng tôi mổ khám ngay và nhận thấy chủ yếu phổi, tim bị xuất huyết. Sau đó chúng tôi lấy bệnh phẩm (gan, thận, lách, tim, phổi) và nuôi cấy trên môi trường
Baird-Parker. Theo Rosamund et al. (1995) nhận dạng khuẩn lạc
Staphylococcus aureus trên môi trường Baird-Parker tạo khuẩn lạc điển hình có màu đen hoặc xám bóng và lồi, có một vòng trắng đục tiếp giáp với khuẩn lạc. Từ đó chúng tôi xác định được nguyên nhân gây chết chuột là do chủng
nhận thấy: trên gan mật độ vi khuẩn dày đặc, phải qua 2 lần cấy chuyển chúng tôi mới thấy được khuẩn lạc rời. Kế đó là thận, mật độ khá dày nhưng có thể thấy được khuẩn lạc rời. Trên lách số lượng khuẩn lạc tương đối nhiều và phổi có khoảng hơn chục khuẩn lạc. Chỉ có một vài khuẩn lạc đối với mẫu tim. Như vậy, khi gây bệnh trên chuột với vi khuẩn Staphylococcus aureus khi đó vi khuẩn chủ yếu đi đến gan, thận, lách và phổi.
Hình 4.1 Khuẩn lạc Staphylococcus aureus được phân lập từ gan sau 2 lần cấy chuyển
Hình 4.2 Khuẩn lạc Staphylococcus aureus được phân lập từ thận và lách
Hình 4.3 Khuẩn lạc Staphylococcusaureus được phân lập từ phổi và tim
Phổi Tim Thận Lách Gan Gan Gan
4.1.2 Bệnh tích trên chuột khi thử nghiệm xác định liều LD50
Sau 5 ngày theo dõi, đến ngày thứ 6 chúng tôi mổ khám và ghi nhận kết quả được trình bày ở bảng 4.2.
Bảng 4.2 Kết quả mổ khám khi thử liều LD50
Liều gây nhiễm
Bệnh tích
108 cfu/ml 109 cfu/ml 1010 cfu/ml ĐC Số con Tỉ lệ (%) Số con Tỉ lệ (%) Số con Tỉ lệ (%) Số con Tỉ lệ (%) Tích mủ ở gan, thận, lách, ruột, dạ dày và xoang bụng 2 16,67ac 7 77,78bc 3 75,00c 0 0,0 Tích mủ dưới da 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 Hoại tử vùng tiêm 0 0,0ab 1 11,11bc 3 75,00c 0 0,0 Gan, thận sưng và nhạt màu, lách sưng 3 25,00a 7 77,78bc 4 100c 0 0,0 Không có bệnh tích mủ 10 83,33a 0 0,0b 0 0,0c 18 100a
Các chữ a, b, c trong cùng một dòng sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức 1% (p<0,05).
Kết quả mổ khám nhận thấy:
Ở nồng độ tiêm 108 cfu/ml có 16,67% chuột tích mủ trong số các cơ quan gan, thận, lách, ruột, dạ dày và xoang bụng. Qua Bảng 4.2 cho thấy, bệnh tích này sai khác có ý nghĩa thống kê (p< 0,05) với nồng độ 109 cfu/ml với tỉ lệ là 77,78% và nồng độ 1010 cfu/ml có tỉ lệ là 75,00%, nhưng giữa nồng độ 109 cfu/ml và 1010 cfu/ml sai khác không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05). Như vậy ở nồng độ vi khuẩn cao thì bệnh tích mủ thể hiện chủ yếu ở nội tạng. Thí nghiệm này không có chuột có bệnh tích mủ dưới da. Về bệnh tích hoại tử ở ngay vùng tiêm, sự sai khác ở 3 nồng độ 108 cfu/ml, 109 cfu/ml và 1010 cfu/ml có ý nghĩa thống kê (p< 0,05). Ở nồng độ 108 cfu/ml không ghi nhận được bệnh tích này và sự sai khác này không có ý nghĩa thống kê so với nồng độ 109 cfu/ml (p> 0,05). Nhưng so với nồng độ 1010 cfu/ml có tỉ lệ 73,00% và sự sai khác này rất có ý nghĩa thống kê (p< 0,01). Qua kết quả trên cho thấy bệnh tích hoại tử thường xuất hiện ở nồng độ 109 cfu/ml và 1010 cfu/ml. Về bệnh tích gan thận sưng nhạt màu và lách sưng, sự sai khác có ý nghĩa (p< 0,05) giữa 3 nồng độ 108 cfu/ml, 109 cfu/ml và 1010 cfu/ml. Sự sai khác có ý nghĩa 5% giữa nồng độ 108 cfu/ml (25,00%) và nồng độ 109 cfu/ml (77,78%). Và so với nồng độ 1010 cfu/ml thì cũng sai khác có ý nghĩa thống kê (p< 0,05). Giữa 2 nồng độ 109 cfu/ml và 1010 cfu/ml sai khác không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05). Như vậy mật độ vi khuẩn cao ảnh hưởng chủ yếu đến các cơ quan gan, thận, lách. Những chuột không có bệnh tích mủ và nội tạng bình thường, chỉ có ở nồng độ 108 cfu/ml và nghiệm thức đối chứng. Sự sai khác về số chuột (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
không có bệnh tích mủ giữa 3 nghiệm thức 108 cfu/ml, 109 cfu/ml và 1010 cfu/ml rất có ý nghĩa thống kê (p< 0,01) những giữa nồng độ 108 cfu/ml và đối chứng sai khác không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05). Như vậy khi gây nhiễm ở nồng độ 108 cfu/ml không gây bệnh cho chuột.
Những bệnh tích mà chúng tôi ghi nhận được khi gây bệnh chuột với chủng Staphylococcus aureus hoàn toàn phù hợp với Cheng et al. (2009) khi thử nghiệm liều LD50 trên chuột nhận thấy Staphylococcus aureus chủ yếu di cư đến thận và gây ra các ổ áp xe trên thận. Theo Sanne et al. (2011) gây
nhiễm chuột với chủng Staphylococcus aureus sau 10 ngày mổ khám quan sát
thấy bệnh tích mủ trên gan.
Hình 4.4 Tích mủ ở thận và gan
Theo Hasegawa et al. (1978), khi gây nhiễm vi khuẩn Staphylococcus aureus nhận thấy các ổ áp xe trên thận, cơ, phổi, gan, xương và nhiều cơ quan khác. Bên cạnh đó Dean et al. (2007), cho rằng đặc điểm để phân biệt với các bệnh khác là vi khuẩn gây hoại tử da.
Hình 4.5 Tích mủ lách, xoang bụng và gan nhạt màu
Theo Reed-Muench (1938), chúng tôi tính ra được liều LD50 là 3,74x109 cfu/ml. Theo những nghiên cứu trước chúng tôi thấy rằng: vi khuẩn mang những độc lực khác nhau thì liều LD50 khác nhau. Cụ thể theo Eunice (1983) mặc dù trên cùng chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus nhưng với các loại
độc tố khác nhau, vào thời điểm khác nhau thì liều LD50 khác nhau hoàn toàn và thay đổi từ 7,3x108 cfu/ml đến 2,1x1010 cfu/ml. Quinton et al. (2011), phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus từ thực phẩm cho thấy liều gây chết 50% số chuột từ 3,5x108 cfu/ml đến 5x108 cfu/ml. Ngoài ra, cùng chủng vi khuẩn
Staphylococcus aureus nhưng liều gây chết còn phụ vào đường gây nhiễm. Theo Van et al. (2013) khi gây nhiễm Staphylococcus aureus thông qua đường tĩnh mạch thì liều gây chết 50% là 3x105 cfu/ml. Kết quả của Michael (1982), khi tiêm qua đường tĩnh mạch 2 loại độc tố α-toxin, α-lysin gây chết chuột ở liều 40-60 ng/Kg thể trọng. Đối với độc tố δ-lysin có liều gây chết là 110 mg/Kg thể trọng. Trong khi đó, độc tố β-lysin không gây chết chuột ở liều 7 ng/Kg thể trọng, đối với độc tố γ-lysin liều gây chết ít hơn 1 mg/Kg thể trọng và 2 độc tố enterotoxin A và enterotoxin B không gây chết chuột ở liều 2,5 mg/Kg thể trọng nhưng 2 nội độc tố này sau khi được tăng cường độc lực có thể gây chết chuột do shock. Khi gây nhiễm vi khuẩn bằng đường tiêm xoang bụng theo Susana et al. (2009), Staphylococcus aureus có thể gây chết 50% số chuột ở nồng độ từ 106 cfu/ml đến 1011 cfu/ml. Theo Namavar et al. (1978), liều gây chết 50% số chuột thí nghiệm của vi khuẩn Staphylococcus aureus
khác nhau tùy thuộc độ tuổi của chuột thí nghiệm. Đối với chủng
Staphylococcus aureus được phân lập trên mũi, liều LD50 trên chuột 9 tuần tuổi là 1,5x106 cfu/ml, đối với chuột 2 ngày tuổi là 14,9x104 cfu/ml. Theo Liben et al. (2012), khi phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus trên người và bò bị bệnh viêm vú với chủng Staphylococcus aureus enterotoxin A liều gây chết 50% số động vật nghiệm là 2x109 cfu/ml và Shigenobu et al. (2003) khi tiêm xoang bụng với liều 8x108 cfu/ml gây chết 100% số chuột thí nghiệm.
Như vậy, dựa trên các nghiên cứu trước thì liều LD50 =3.74x109 cfu/ml là hoàn toàn được chấp nhận.
4.2 Kết quả thử nghiệm LD50 trên chuột của chủng Escherichiacoli
4.2.1 Dấu hiệu lâm sàng sau khi thử nghiệm xác định liều LD50
Để xác định liều gây bệnh cho chuột, chúng tôi bố trí thí nghiệm và tìm liều gây chết 50% số chuột. Sau 5 ngày theo dõi kết quả được ghi nhận qua bảng 4.3
Bảng 4.3 Kết quả xác định liều LD50 gây chết của Escherichia coli trên chuột bạch Nghiệm thức Mật độ Escheric hia coli
Số liệu thí nghiệm Theo tần số tích lũy Tổng số chuột Số chết Số sống Số chết Số sống Tổng số Tỷ lệ chết (%) (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) I 1x109 12 0 12 0 26 26 0ab II 2,5x109 12 3 9 3 14 17 17,65b III 5x109 12 7 5 10 5 15 66,67c IV 1x1010 12 12 0 22 0 22 100d PD LD50 0,3400652795 2,29 x109
Ghi chú: PD (proportional distance) khoảng cân đối; LD50 là liều gây chết 50% chuột thí nghiệm Các chử số a, b, c, d trong cùng một cột sai khác có ý nghĩa thống kê (p<0,05).
Cột (1), (2), (3) số liệu thí nghiệm
Cột (4) là tổng các trị số của cột (2) tính từ hàng trên cùng đến hàng đó Cột (5) là tổng các trị số của cột (3) tính từ hàng cuối cùng đến hàng đó Cột (6) mỗi hàng là tổng của cột (4) và cột (5) thuộc hàng đó
Cột (7) là tỷ lệ cột (4) so với cột (6)
Ở thí nghiệm 1 (nồng độ vi khuẩn 1x109 cfu/ml) nhận thấy: thân nhiệt chuột tăng lên khoảng 0,5 – 3oC, chuột ăn và uống ít hơn, nằm im, co cụm lại với nhau sau khi gây nhiễm khoảng 8 giờ thấy tiêu phân hơi ướt. Sau ngày đầu tiên, thân nhiệt trở lại gần như mức bình thường. Đến ngày thứ 3 chuột hoạt động nhanh nhẹn và ăn uống bình thường. Qua Bảng 4.2 thì sau 5 ngày theo dõi không ghi nhận được số chuột chết ở nồng độ 108 cfu/ml. Sự sai khác về tỉ lệ chết ở nghiệm thức này so với tỉ lệ chết ở nghiệm thức 2 không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05). Đồng thời so với tỉ lệ chết ở nghiệm thức 3 và 4, sự sai khác này rất có ý nghĩa thống kê (p< 0,01).
Đối với thí nghiệm 2 (nồng độ vi khuẩn 2,5x109 cfu/ml) sau khi gây nhiễm 7 giờ chuột bỏ ăn, uống, hoạt động chậm chạp, thở mạnh và tiêu chảy phân ước, dinh thành dây và có màu vàng, sau khoảng thời gian này bắt đầu ghi nhận được số chuột chết. Tỉ lệ chuột chết là 17,65% số chuột thí nghiệm. Tỉ lệ chuột chết ở nghiệm thức này sai khác so với nghiệm thức 3 có ý nghĩa thống kê (p< 0,05) thể hiện trên Bảng 4.2 và sai khác rất có ý nghĩa so với nghiệm thức 4 (p< 0,01). Thân nhiệt trên các chuột thí nghiệm tăng khoảng 4 – 5oC, nhưng hầu hết giảm trở lại mức gần như bình thường sau khi qua ngày thứ 3, thứ 4.
Đối với nghiệm thức tiêm ở nồng độ 5x109 cfu/ml, ở ngày thứ nhất (cách 6 giờ sau khi tiêm) chuột chết, bỏ ăn uống, nằm co cụm, thở mạnh và tiêu chảy nặng phân sệt màu vàng hoặc xám trên tất cả số chuột thí nghiệm. Tỉ số chuột
chết ở thí nghiệm này là 66,67%. Ở nồng độ 5x109 cfu/ml tỉ lệ chết cao hơn nồng độ 2,5x109 cfu/ml và sự sai khác này sai khác rất có ý nghĩa thống kê. Thân nhiệt các chuột thí nghiệm tăng rất cao khoảng 4 – 7oC, bỏ ăn ở ngày đầu và các ngày sau chuột ăn, uống rất ít. Các chuột chết đều có biểu hiện hô hấp rõ rệt: thở mạnh, tim đập nhanh, biểu hiện khó thở, chạy xung quanh và co giật trước khi chết.
Đối với nồng độ tiêm 1x1010 cfu/ml chuột bắt đầu chết chỉ sau 4 giờ gây nhiễm,chuột chết, bỏ ăn uống, nằm co cụm, thở mạnh và tiêu chảy rất nặng phân lỏng, sệt màu vàng hoặc xám trên tất cả số chuột thí nghiệm ở liều này thì chuột chết 100% sai khác rất có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Ngoài các triệu chứng trên thì sau 30 phút tiêm vi khuẩn thân nhiệt chuột bắt đầu tăng và tăng rất cao khoảng 8 – 9oC.
Qua Bảng 4.2 cho thấy, tỷ lệ chết 50% trên chuột sau khi gây nhiễm
Escherichia coli ở mật độ 2,29x109 cfu/ml. Ở mật độ 1x1010 cfu/ml có tỷ lệ chuột chết 100%, ở mật độ 1x109 cfu/ml không gây chết. Ở mật độ cao gây
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});