Thí nghiệm LD50 được tiến hành nhằm xác định độc lực của vi khuẩn có khả năng gây chết 50% ở chuột thí nghiệm.
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên (bảng 3.3), 1 nhân tố với 4 mức độ gây nhiễm đối với Staphylococcus aureus là (NT1: 108 cfu/ml; NT2: 109 cfu/ml; NT3: 1010 cfu/ml; NT4: 1011 cfu/ml) và
Escherichia coli là (NT1: 1x109 cfu/ml; NT2: 2,5x109 cfu/ml; NT3: 5x109 cfu/ml, NT4: 1x1010 cfu/ml), 3 lần lập lại, 12 đơn vị thí nghiệm.
Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm xác định liều gây chết 50% (LD50)
Nghiệm thức Lặp lại NT1 NT2 NT3 NT4 1 4 4 4 4 2 4 4 4 4 3 4 4 4 4
Phương pháp tiến hành: gây nhiễm trên chuột bạch bằng cách tiêm xoang bụng, với thể tích tiêm 1 ml ở từng nghiệm thức.
Vi khuẩn Staphyloccoccus aureus và Escherichia coli sau nuôi cấy tăng sinh trên môi trường NA ở 37oC trong 24 giờ, sau đó được chuyển vào môi trường PBS (pH= 7,4) để nuôi tăng sinh trong 4 giờ, trong quá trình nuôi cấy có lắc kích thích tăng sinh của vi khuẩn. Lấy 2 ml dung dịch trên đem ly tâm ở 10.000 vòng/phút ở 4oC trong 10 phút. Phần dung dịch nổi bên trên sau khi ly tâm được bỏ đi, phần lắng phía đáy được rửa 2 lần với dung dịch Ringer’s solution. Phần vi khuẩn lắng phía dưới sẽ được pha loãng với dung dịch Ringer’s solution đến khi đạt nồng độ 1011 cfu/ml theo tiêu chuẩn McFarland Standard (kiểm tra lại mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ với bước sóng 600 nm, điều chỉnh OD-1±0,1). Pha loãng dung dịch vi khuẩn 10 lần để được các mật độ 1010 cfu/ml, 109 cfu/ml, 108 cfu/ml (Liben et al., 2012).
Thời gian theo dõi sau khi gây cảm nhiễm là 5 ngày. Sau khi gây nhiễm theo dõi dấu hiệu bệnh lý, số chuột chết. Tiến hành phân lập và nuôi cấy vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm (tim, phổi, gan, thận, lách) ở những chuột chết trong khoảng 1 – 2 ngày. Cắt nhỏ mẫu cơ quan phủ tạng hòa tan trong dung dịch nước muối sinh lý. Chan đĩa trên môi trường chuyên biệt để xác định nguyên nhân gây chết của chuột. Sau 5 ngày theo dõi, đến ngày thứ 6 tiến hành mổ khám để ghi nhận dấu hiệu bệnh tích trên chuột.
Phương pháp tính LD50 dựa theo Reed-Muench (1938).
Tỷ lệ nhiễm chết thấp nhất >50% - 50% PD =
Tỷ lệ nhiễm chết thấp nhất> 50% - Tỷ lệ nhiễm chết cao nhất < 50% LD50= 10(lũy thừa của nồng độ gây chết trên 50% nhỏ nhất - PD)
Ghi chú: PD (proportional distance) khoảng cân đối; LD50 là liều gây chết 50% động vật thí nghiệm