Chuẩn bị:
- Trước khi thực hiện, tủ nuôi cấy tế bào và dụng cụ được khử trùng bằng cách lau cồn 700 và chiếu tia UV trong khoảng 10-15 phút.
- Dùng bông gòn thấm cồn 700 để lau trứng, đưa vào tủ nuôi cấy.
Thực hiện nuôi cấy tế bào: DEK, DEL
- Dùng kéo lớn vô trùng làm rạn đỉnh của trứng và bóc dần vỏ đến rìa của buồng khí.
- Dùng kẹp vô trùng bóc lớp màng lụa và chọc thủng màng đệm (CAM) trước khi kẹp nhẹ phần bên dưới đầu để nhấc phôi ra.
- Kiểm tra phôi trước khi đưa vào đĩa petri có chứa sẵn dung dịch đệm DPBS. Loại phôi nhợt nhạt, tim không đập (phôi chết), phôi nhiều lông (dễ gây tạp, dòng tế bào không đồng nhất).
- Rữa phôi trong đệm DPBS, Lấy phần tế bào cần nuôi cấy loại bỏ những phần không cần thiết. Chú ý với thận phôi vịt thì ta nên lấy thận từ nhiều phôi trở lên vì thận phôi khá nhỏ.
- Chuyển phần cần lấy nuôi cấy vào đĩa petri khác có sẵn đệm DPBS. Dùng kéo nhỏ vô trùng cắt nhỏ. Nghiêng đĩa cho các khối nhỏ lắng xuống và chắt bỏ phần dịch đệm bên trên.
- Cho đệm DPBS vào đĩa và tiếp tục rửa để loại huyết cầu, tạp bẩn đến khi thấy phần dịch nước trong.
- Chuyển các mẫu nhỏ phôi vào erlen 50 ml, bổ sung khoảng 10 ml dung dịch trypsine 0,25%-EDTA 0,2% lắc đều và để yên vài phút trước khi chắt bỏ dịch nước bên trên.
- Thêm khoảng 10 ml dung dịch trypsine 0,25%-EDTA 0,2% vào erlen. Cho cá từ vào, đậy kín erlen và đặt lên máy khuấy từ.
- Khuấy từ được 30 phút, đễ các mảnh mô ổn định lại rồi chắt lấy phần dịch n ước bên trên cho vào ống falcon và đặt trong cốc nước đá. Phần cặn còn lại trong erlen thêm một ít dung dịch trypsine 0,25% -EDTA 0,2%, khuấy từ tiếp tục trong 15 phút.
- Lọc huyền phù tế bào qua phểu sạch, vô trùng cho vào ống falcon. Đem hai ống falcon ly tâm thường 1000 - 2000 vòng/phút trong 15 phút,
- Ly tâm xong rút bỏ phần nước trên bằng micropipette, hòa chung phần cặn hai ống lại và thêm một ít đệm DPBS, trộn đều đem ly tâm khoảng 1-2 lần với đệm DPBS
- Ly tâm xong rút bỏ phần đệm trong ống falcon ra, thêm môi trường tăng trưởng (MTTT) và ly tâm tiếp tục trong 15 phút, 1000 - 2000 vòng/phút. Rút bỏ môi trường ra và cho MTTT mới vào, trộn đều bằng micropipette.
- Rút ra 0,1 ml huyền phù tế bào và 0,1 ml Trypan blue 0,3% (theo tỷ lệ 1:1), đếm tế bào dưới buồng đếm Neubauer để xác định mật độ tế b ào ban đầu.
- Từ mật độ tế bào ban đầu tính ra thể tích và mật độ tế bào cần nuôi cấy, sau đó phân phối vào các đĩa microplate theo nồng độ và bố trí thích hợp theo yêu cầu thí nghiệm.
- Đem đĩa nuôi cấy vào ủ trong tủ ấm 370C, 5% CO2, độ ẩm 80%. Theo dõi sự phát triển của tế bào cho đến khi thu được môi trường tế bào một lớp.
Cơ chế nhuộm MTT
Thuốc nhuộm MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) là loại thuốc nhuộm được dùng trong xác định tính độc tế bào của một tác nhân nghiên cứu hoặc đánh giá sự phát triển của tế bào nuôi cấy (Mosmann, 1983). Khi cho vào môi trường tế bào, MTT có màu vàng sẽ chuyển thành tinh thể formazan đỏ tía dưới tác dụng của enzyme dehydrogenase của ty thể trong tế bào sống, do vậy lượng tinh thể sinh ra sẽ phụ thuộc mật độ tế bào sống có trong môi trường. Tinh thể muối này không hòa tan được trong dung dịch có nước và được giữ lại trong tế bào
(Altman, 1976). Nhưng tinh thể có thể hòa tan được trong isopropanol có tính acid hoặc DMSO cho dung dịch đỏ tía, nồng độ của tinh thể có thể đánh giá bằng phương pháp đo mật độ quang (OD). Giá trị OD thu được tỷ lệ với lượng tinh thể hình thành trong tế bào sống, qua đó đánh giá được mức tăng trưởng của tế bào cũng như tác động gây chết tế bào của tác nhân nghiên cứu.
Trong các thí nghiệm 1 và thì nghiệm 2 sau khi các giếng tạo lớp trong khoảng 5 ngày thì tiến hành nhuộm MTT, xác định giá trị mật độ quang OD ở bước song 620 nm.
Để đo mật độ quang OD620 tiến hành theo các bước sau: - Rút bỏ MTTT ra khỏi giếng nuôi cấy, rữa 1 lần bằng DPBS .
- Cho vào mỗi giếng 50 μl MTT, đem ủ 370C, 5% CO2, tránh ánh sáng, ủ trong 4 giờ. Chú ý khi đưa thuốc nhuộm MTT vào giếng cần tránh thuốc nhuộm tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng.
- Sau khi ủ, loại MTT ra khỏi giếng. Cho 100μl isopropanol vào các giếng. Lắc máy 30 phút, 600 vòng/phút.
- Đem vào máy đọc giá trị OD620.