bổ sung vào môi trường tăng trưởng MEM lên hiệu quả tạo lớp đơn tế bào.
Nồng độ tế bào ban đầu được xác định bằng cách đếm tế bào dưới buồng đếm Neubauer. Sử dụng công thức C1V1=C2V2 đễ pha loãng tế bào rồi đếm.
Mục tiêu: Xác định nồng độ huyết thanh bổ sung vào môi trường ảnh hưởng đến hiệu quả tạo lớp của 2 loại tế b ào (DEK, DEL) theo điều kiện thí nghiệm.
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được thực hiện trên 24 giếng cho mỗi loại tế bào theo 2 vị trí C và D (như hình 3.3). Trong đó vị trí C là dùng để nuôi cấy tế bào DEK, vị trí D là dùng để nuôi cấy tế bào DEL. Loại MTTT được sử dụng là MEM. Huyết thanh FBS được bổ sung vào môi trường với 4 nồng độ 0%, 2%, 5%, 10%. Mỗi nồng độ huyết thanh được
thử nghiệm với nồng độ pha loãng tế bào là 5x105 μl/giếng, trong đó mỗi nồng độ huyết thanh được lập lại 6 lần.
Hình 3.3 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ huyết thanh lên hiệu quả tạo lớp đơn tế bào
Sau khi phân phối xong, đưa vào tủ ấm CO2 để nuôi. Theo dõi sự phát triển của tế bào ba lần trong ngày: 8 giờ sáng, 14 giờ chiều và 20 giờ. Quan sát và ghi nhận lại bằng hình ảnh.
Các giếng được nhuộm với MTT cùng một lúc với thí nghiệm 1, đem đọc giá trị OD620.
Các chỉ tiêu theo dõi
- Thời gian trung bình tạo lớp tế bào đơn của 2 loại tế bào (khoảng 80 - 90% đáy giếng) (giờ).
- Hình thái tạo lớp 2 loại đơn tế bào. - Giá trị OD620 trung bình.
3.4.3 Thí nghiệm 3: Nuôi cấy thử nghiệm Virus viêm gan vịt type 1 (DHV-1) trên 2 loại môi trường DEK và DEL.
Bố trí thí nghiệm:
Hình 3.4 Hình bố trí thí nghiệm gây nhiễm DHV-1 trên 2 loại tế bào
Các tế bào được nuôi cấy trên một đĩa microplate 96 giếng, chia ra làm 2, mỗi bên 48 giếng (như hình 3.4) một bên dùng để nuôi cấy tế bào DEK và một bên để nuôi cấy tế bào DEL. Loại môi trường được sử dụng là MEM có bổ sung 10% huyết thanh FBS và nồng độ nuôi cấy là 5x105 tb/ml. Sau khi 2 tế bào tạo lớp thì tiến hành gây nhiễm virus DHV-1 với liều 100 TCID50/giếng. Sau khi phân phối xong, đưa vào ủ ở tủ ấm 370C, 5% CO2. Theo dõi thời gian xuất hiện CPE của 2 loại môi trường, đến khi nào CPE ổn định thì đem nhuộm MTT để đo mật độ quang OD620. Đối chứng là tế bào không gây nhiễm virus chỉ chứa tế bào lớp đơn và môi trường duy trì.
Tác động của DHV-1 thể hiện qua việc làm chết tế bào nuôi cấy, cụ thể là biểu hiện CPE, được đánh giá bằng phương pháp nhuôm MTT và đo mật độ quang OD620.
Giá trị OD620 sẽ tỷ lệ thuận với số lượng tế bào sống. Từ đó, ta có thể xác định được mức độ phá hủy tế bào nuôi cấy của DHV-1 đối với từng loại tế b ào.
Tỷ lệ tế bào sống trung bình (%)= (OD620DHV-1/OD620ĐC)x100
Trong đó: OD620DHV-1: giá trị OD620 trung bình đo được ở các giếng gây nhiễm virus
OD620ĐC: giá trị OD620 trung bình đo được ở các giếng đối chứng không gây nhiễm virus.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Thời gian trung bình tạo CPE trên từng loại tế bào. - Giá trị OD620 trung bình.
- Tỷ lệ tế bào sống.
CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Thí nghiệm 1: Xác định nồng độ tế bào nuôi cấy thích hợp với điều kiện thí nghiệm.
Đĩa thí nghiệm được quan sát ở 3 thời điểm cố định: 8 giờ, 14 giờ và 20 giờ trong ngày.Khi các tế bào tạo lớp ghi nhận số giếng tạo lớp ở mỗi nồng độ và ghi nhận bằng các hình ảnh chụp được qua kính hiển vi, chúng tôi thu được kết quả như sau:
0 20 40 60 80 100 120 140 1 2 3 4 Mật độ ax105 (tb/ml) Thờ i gi a n (gi ờ ) DEK DEL
Hình 4.1 Biểu đồ thời gian trung bình tạo lớp 2 loại tế bào với các nồng độ nuôi cấy ban đầu ax105 tb/ml
Dưới đây là các hình ảnh ghi nhận được qua quá trình theo dõi thí nghiệm liên tục ở các khoảng thời gian 0 giờ (tính từ khi đưa đĩa vào tủ ấm), 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 120 giờ: - Nồng độ nuôi cấy 3x105 tb/ml A B
Hình 4.2 Thời gian tạo lớp của 2 loại tế b ào DEK (A) và DEL (B) từ nồng độ nuôi cấy ban đầu là 3x105 tb/ml
0 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ
- Nồng độ nuôi cấy 5x105 tb/ml
A
B
Hình 4.3 Thời gian tạo lớp của 2 loại tế b ào DEK (A) và DEL (B) từ nồng độ nuôi cấy ban đầu là 5x105 tb/ml
0 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ
- Nồng độ độ nuôi cấy 7x105 tb/ml
A
B
Hình 4.4 Thời gian tạo lớp của 2 loại tế b ào DEK (A) và DEL (B) từ nồng độ nuôi cấy ban đầu là 7x105 tb/ml
0 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ
- Nồng độ nuôi cấy 10x105 tb/ml
A
B
Hình 4.5 Thời gian tạo lớp của 2 loại tế b ào DEK (A) và DEL (B) từ nồng độ nuôi cấy ban đầu là 10x105 tb/ml
0 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ
Bảng 4.1 Thời gian trung bình tạo lớp tế bào với các nồng độ nuôi cấy ban đầu của 2 loại tế bào DEK và DEL
Số giếng Nồng độ tế bào nuôi cấy ban đầu (tb/giếng)
Thời gian trung bình tế bào phủ 90% diện tích giếng(X SEM) (giờ)
DEK DEL
6 3x105 81,83d 1,17 -
6 5x105 62,33c 1,21 118,67a 1,21
6 7x105 43,67b 1,37 108,17b 1,17
6 10x105 38,50a 0,84 86,33c 1,03
Chú thích: Những giá trị trong cùng một cột có những chữ mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05)
Khi các tế bào tạo lớp ở các mật độ khác nhau, chúng tôi tiến hành nhuộm MTT và đo mật độ quang OD620, kết quả được thu nhận như sau:
Bảng 4.2 Giá trị OD620 trung bình theo nồng độ tế bào nuôi cấy ban đầu của 2 loại tế bào DEK và DEL
Số giếng Nồng độ tế bào nuôi cấy ban đầu (tb/giếng)
Giá trị OD620 trung bình (X SEM)
DEK DEL
6 3x105 0,169c 0,007 0,093c 0,015
6 5x105 0,231b 0,013 0,151b 0,029
6 7x105 0,264a 0,016 0,171b 0,026
6 10x105 0,268a 0,023 0,214a 0,020
Chú thích: Những giá trị trong cùng một cột có những chữ mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05)
Từ hình ảnh thu được (hình 4.1 - 4.5) và số liệu (bảng 4.1 và bảng 4.2), chúng tôi đưa ra nhận xét như sau:
Về thời gian: Nhận thấy rằng, ở nồng độ 10x105 tb/ml thì ở 2 loại tế bào nuôi cấy tạo lớp nhanh nhất (DEK khoảng 38,5 giờ và DEL khoảng 86,33 giờ), tiếp đến là 7x105 tb/ml (DEK là 43,67 giờ và DEL là 108,17 giờ), kế đến là 5x105 tb/ml (DEK là 62,33 giờ và 118,67 giờ) và cuối cùng là 3x105 tb/ml thì chỉ có tế bào DEK tạo lớp (81,83 giờ). Sự khác biệt về thời gian tạo lớp là có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Có thể
giải thích do mật độ nuôi cấy ban đầu cao, khoảng cách giữa các tế bào gần, nên khi vào giai đoạn phát triển (kéo dài) các tế bào không chỉ bám vào đáy giếng mà còn bám vào các tế bào khác làm giá đỡ cho chúng phát triển, nên ở nồng độ 10x105 tb/ml sẽ cho tốc độ tạo lớp nhanh nhất. Ngược lại, ở nồng độ 3x105 tb/ml do số lượng tế bào ít nên chỉ tạo lớp với điều kiện nuôi cấy trong thời gian d ài, môi trường nuôi cấy còn dinh dưỡng thì chúng vẫn tạo lớp.
Về hình thái, Ở thời điểm bắt đầu đưa vào tủ ấm (0 giờ) ở các nồng độ các tế bào phân bố khá đều, sau 24 giờ thì các tế bào nuôi cấy bắt đầu bám vào đáy giếng và bám vào nhau tạo thành các cụm, một số tế bào bắt đầu kéo dài sau một khoảng thời gian các tế bào nuôi cấy hình thành lớp đơn, về hình thái tạo lớp đơn thì ở các nồng độ 5x105 tb/ml và 7x105 tb/ml có hình thái tạo lớp tốt nhất vì khi hình thành lớp số tế bào tròn còn lại ít, lớp hình thành phân bố khá đều.
Về giá trị OD620, thì nồng độ 10x105 tb/ml có tỷ lệ tế bào sống cao nhất (DEK là 0,268 và DEL là 0,214), tiếp đến là 7x105 tb/ml (DEK là 0,264 và DEL là 0,171), tiếp đến là 5x105 tb/ml (DEK là 0,231 và DEL là 0,151) và cuôi cùng là 3x105 tb/ml (DEK là 0,169 và DEL là 0,93). Ở tế bào DEK giữa 2 nồng độ 7x105 tb/ml và nồng độ 10x105 tb/ml sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05), tương tự ở tế bào DEL ở 2 nồng độ 5x105 tb/ml và 7x105 tb/ml sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Có thể giải thích như sau: ở tế bào DEK, trong khoảng thời gian nuôi cấy khá dài các tế bào ở nồng độ 10x105 tb/ml bước vào giai đoạn suy giảm, 7x105 tb/ml vẫn còn đang ở giai đoạn phát triển nên giá trị OD620 giữa 2 nồng độ này là tương đương nhau (hình 4.4 và hình 4.5 ở 120 giờ); Ở tế bào DEL, giữa 2 nồng độ 5x105 tb/ml và nồng độ 7x105 tb/ml vẫn còn đang ở giai đoạn phát triển, tuy nhiên do các tế bào có kích thước nhỏ và khả năng bám dính kém nên tại thời điểm đo giá trí OD620 không chênh lệch nhiều.
Kết luận, về nồng độ nuôi cấy ban đầu tế bào DEK có tốc độ tạo lớp nhanh hơn tế bào DEL. Trong các thí nghiệm virus học khi sử dụng môi trường tế bào thận và gan phôi vịt trong điều kiện in vitro tùy mục đích thí nghiệm và có yêu cầu về thời gian thí nghiệm ngắn, số lượng mẫu nhiều, không chuyên biệt về tế bào cần thí nghiệm thì nên sử dụng tế bào DEK. Nếu các thí nghiệm, tùy vào virus có tính hướng một tổ chức chuyên biệt nào thì ta có thể sử dụng loại tế bào đó cho thí nghiệm.
4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ huyết thanh FBS bổ sung vào môi trường tăng trưởng MEM lên hiệu quả tạo lớp đơn tế bào
Kết quả thí nghiệm này chủ yếu dựa vào quan sát theo dõi dưới kính hiển vi trong suốt quá trình phát triển của tế bào DEK và tế bào DEL dưới ảnh hưởng của các nồng độ huyết thanh. Kết quả thu được như sau:
Các hình ảnh về hình thái tế bào phát triển trong 4 môi trường tăng trưởng được bổ sung các nồng độ huyết thanh khác nhau sau khi theo dõi ở thời điểm 0 giờ (bắt đầu đưa đĩa vào tủ ấm), 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ, 120 giờ.
- 0% huyết thanh
A
B
Hình 4.6 Hiệu quả tạo lớp của 2 loại tế bào DEK (A) và DEL (B) trong môi trường MEM không bổ sung huyết thanh
0 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ
- 2% huyết thanh A B
Hình 4.7 Hiệu quả tạo lớp của 2 loại tế bào DEK (A) và DEL (B) trong môi trường MEM bổ sung 2% huyết thanh
0 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ
- 5% huyết thanh
A
B
Hình 4.8 Hiệu quả tạo lớp của 2 loại tế bào DEK (A) và DEL (B) trong môi trường MEM bổ sung 5% huyết thanh
0 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ
- 10% huyết thanh
A
B
Hình 4.9 Hiệu quả tạo lớp của 2 loại tế bào DEK (A) và DEL (B) trong môi trường MEM bổ sung 10% huyết thanh
0 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ
Bảng 4.3 Hiệu quả thời gian tạo lớp tế bào tương ứng với 4 nồng độ huyết thanh qua 3 thời điểm quan sát trên 2 loại tế bào
Số giếng Nồng độ huyết thanh (%)
Thời gian trung bình tế bào phủ 90% diện tích giếng(X SE) (giờ)
DEK DEL
6 0% 118,50a 1,05 -
6 2% 94,50b 0,55 -
6 5% 68,17c 0,98 -
6 10% 62,5d 0,84 118,50 0,837
Chú thích: Những giá trị trong cùng một cột có những chữ mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05)
Khi các tế bào bắt đầu tạo lớp thì tiến hành nhuộm MTT và đo OD620, ta thu được kết quả như sau:
Bảng 4.4 Giá trị OD620 sau đo được sau 120 giờ nuôi cấy 2 loại tế bào theo 4 nồng độ huyết thanh
Số giếng Nồng độ huyết thanh (%)
Giá trị OD620 trung bình(X SE)
DEK DEL
6 0% 0,147c 0,013 0,067c 0,004
6 2% 0,202b 0,035 0,082b 0,006
6 5% 0,228ab 0,033 0,105a 0,017
6 10% 0,256a 0,010 0,113a 0,009
Chú thích: Những giá trị trong cùng một cột có những chữ mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05)
Từ hình ảnh ghi nhận được (hình 4.6 – 4.9) và số liệu (bảng 4.3 và 4.4), chúng đưa ra nhận xét như sau:
- Về thời gian: Đối với tế bào DEK, nồng độ huyết thanh bổ sung 10% có tốc độ tạo lớp nhanh nhất (62,5 giờ), tiếp đến nồng độ 5% (68,17 giờ), tiếp đến là nồng độ 2% (94,5 giờ) và cuối cùng là nồng độ 0% (118,5 giờ); Đối với tế bào DEL chỉ có nồng độ 10% huyết thanh bổ sung là tạo lớp (118,5 giờ). Sự khác biệt về thời gian tạo lớp giữa các nồng độ huyết thanh bổ sung ở mỗi loại tế bào là có ý nghĩa thống kê (P <
0,05). Có thể giải thích về khác biệt tạo lớp giữa các nồng độ huyết thanh khác nhau như sau: Trong huyết thanh bổ sung có chứa các chất dinh dưỡng, và yếu tố kích thích phát triển tế bào tạo lớp càng nhanh. Ngoài ra, Huyết thanh bổ sung có tác dụng làm trung hòa trypsine còn sót lại trong quá trình tách tế bào ra khỏi mô bằng phương pháp trypsine hóa, khi đó huyết thanh bổ sung sẽ cung cấp một lượng protein để trypsine thủy phân, làm giảm ảnh hưởng của trypsine lên tế bào nuôi cấy. Về sự khác nhau về thời gian tạo lớp giữ 2 loại tế bào, do tế bào DEL có kích thước nhỏ hơn tế bào DEK nên trong quá trình tách tế bào ra khỏi mô (do trypsine hóa, do ly tâm, nhiệt độ phòng...) dễ bị stress hơn tế bào DEK làm ảnh hưởng đến tốc độ tạo lớp của chúng. Do đó, tế bào DEL có tốc độ tạo lớp chậm hơn tế bào DEK.
Về hình thái: Lúc mới đưa vào các đĩa cấy (0 giờ) các tế bào phân bố khá đều, nhưng sau 1 ngày các tế bào từ từ bám bào đái giếng và bám vào nhau để phát triển ( hình 4.6, hình 4.7, hình 4.8, hình 4.9 ở 24 giờ), khi các tế bào kéo dài càng lúc càng nhiều thì lớp đơn sẽ được hình thành. Ở tế bào DEL, các nồng độ huyết thanh bổ sung 0%, 2%, 5% không tạo lớp chứng tỏ rằng nồng độ huyết thanh bổ sung không đủ để các tế bào phát triển tạo thành lớp.
Về giá trị OD620: Nhận thấy nồng độ huyết thanh càng cao thì giá trị OD620 càng cao. Tế DEK ở các nồng độ huyết thanh 0%, 2%, 5%, 10% tương ứng với các giá trị OD620 là 0,147, 0,202, 0,228, 0,256, sự khác biệt là ý nghĩa thống kê (P <0,05). Ở nồng độ huyết thanh 2% và 5%, 5% và 10% sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Điều này có thể giải thích như sau: giữa 2% và 5% do sự chênh lệch giữa 2 nồng độ không lớn nên sự phát triển tế bào DEK không có sự chênh lệch lớn, giữa 5% và 10% thì ở 10% huyết thanh các tế bắt đầu vào pha suy giảm (hình 4.9A – 96 giờ) còn các tế bào ở 5% vẫn còn đang kéo dài nên tại thời điểm do (hình 4.8A – 96 giờ), giá trị OD620 giữa 2 nồng độ có sự chênh lệch không lớn. Tế bào DEL, chỉ có nồng độ