kiện thí nghiệm.
Nồng độ tế bào ban đầu được xác định bằng cách đếm tế bào dưới buồng đếm Neubauer. Sử dụng công thức C1V1=C2V2 đễ pha loãng tế bào rồi đếm.
Mục tiêu: Xác định mật độ nuôi cấy ban đầu cho hiệu quả tạo lớp đều, đồng nhất. Thời gian tạo lớp thích hợp với điều kiện thí nghiệm.
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được thực hiện trên 24 giếng cho mỗi loại tế bào theo 2 vị trí A và B (như hình 3.2). Trong đó vị trí A là dùng để nuôi cấy tế bào DEK từ các nồng độ nuôi cấy ban đầu, vị trí B là dùng để nuôi cấy tế bào DEL từ các nồng độ nuôi cấy ban đầu.
Loại MTTT được sử dụng là MEM có bổ sung 10% huyết thanh. Hai loại tế bào DEK, DEL được pha loãng ra 4 nồng độ 3x105, 5x105, 7x105 và 10x105 tb/ml, sau đó phân phối các nồng độ này vào các giếng với lượng thể tích 100 μl/giếng, mỗi nồng độ tế bào được lập lại 6 lần (6 giếng).
Hình 3.2 Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ thích hợp cho nuôi cấy
Sau khi phân phối xong, đưa vào tủ ấm CO2 để nuôi cấy. Theo dõi sự phát triển của tế bào ở ba thời điểm cố đinh: 8 giờ sáng, 14 giờ chiều và 20 giờ tối. Quan sát và ghi nhận hình ảnh dưới kính hiển vi soi ngược.
Đến khoảng thời gian xác định khi nồng độ 5x105 tb/ml ở 2 loại tế bào đều tạo lớp thì tiến hành nhuộm MTT, sau đó đem đo mật độ quang OD620.
Chỉ tiêu theo dõi:
-Thời gian trung bình tạo lớp đơn 2 loại tế bào (khoảng 80 - 90% diện tích đáy giếng).
-Hình thái tạo lớp đơn 2 tế bào. - Giá trị OD620 trung bình.
Số liệu được xử lý bằng phép thử ANOVA-One Way, phần mềm Minitab 16.1.