- Khảo sát trên toàn phổ từ 200 nm đến 300
PRC và CPM
- Tiến hành kiểm tra phổ hấp thụ phân tử của PRC và CPM trong các
dung môi có pH = 1 đến 4 để lựa chọn .
- Kiểm tra sự ổn định độ hấp thụ quang của PRC và CPM theo thời gian, nhiệt độ để lựa chọn khoảng thời gian và nhiệt độ thíc
- Khảo sát khoảng tuyến tính của PRC và CPM từ đó xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).
- PRC và CPM
PRC và CPM .
- Định lượng đồng thời PRC, CPM trong mẫu thuốc COLDACMIN và PACEMIN Đánh giá độ tin cậy của phương pháp t
hồi [ 5, 8, 9].
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Nghi
[3, 12, 28].
2.2.2.1. Phương pháp HPLC
Nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho phương pháp HPLC để định lượng đồng thời PRC và CPM.
Xử lý thống kê các kết quả thu được.
X và CPM trong thuốc COLDACMIN và
PACEMIN theo phương pháp HPLC.
2.2.2.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử
PRC và CPM
- .
- 2 COLDACMIN
- 2 ACEMIN
2.3. Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích 2.3.1. Giới hạn phát hiện (LOD) 2.3.1. Giới hạn phát hiện (LOD)
LOD được coi là nồng độ thấp nhất của chất nghiên cứu mà hệ thống phân tích cho tín hiệu phát hiện phân biệt với tín hiệu nền. Trong phân tích trắc
LOD =3.SD
B (2.1) Trong đó:
SD: độ lệch chuẩn của tín hiệu y trên đường chuẩn.
B: độ dốc của đường chuẩn chính là độ nhạy của phương pháp trắc quang.
2.3.2. Giới hạn định lượng (LOQ)
với tín hiệu nền và đạt độ tin cậy tối thiểu 95%, thông thường người ta sử dụng công thức:
10.SD LOQ =
B (2.2)
2.3.3. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp
- , CPM tự
pha chế thông qua sai số
: Tinh toan 0 0 C - C RE% = .100% C (2.3) Trong đó: RE% là sai số tương đối của phép xác định nồng độ các cấu tử.
CTinh toan (µg/mL) là nồng độ tính toán được.
C0 (µg/mL) , CPM
trong hỗn hợp.
- Đánh giá độ đúng của phương pháp đối với các mẫu thu
T C - Re = .100% a a C v (2.4) Trong đó: CT: nồng độ ( hoặc CPM xác định
được trong mẫu sau khi thêm chuẩn.
Ca: nồng độ ( hoặc
.
a: nồng độ ( PRC hoặc CPM
thêm vào mẫu (đã biết).
- Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá thông qua (RSD). n n 2 2 i i i=1 i=1 -μ -C S = = k k C C (2.5) RSD = .100(%) C S (2.6) Trong đó: Ci (µg/mL) PRC hoặc CPM tính được lần thứ i;
là giá trị nồng độ thực của mẫu;
C là giá trị nồng độ trung bình tính được sau n lần xác định; k là số bậc tự do.
2.3.4. Đánh giá kết quả phép phân tích theo thống kê
Khoảng tin cậy của phép xác định nồng độ được tính theo công thức:
P,k
t .S X ± ε = X ±
n (2.7)
Với tP, k là hệ số phân bố chuẩn Student ứng với xác suất P và bậc tự do k được tra trong bảng (t0,95; 3 = 3,18; t0,95; 4 = 2,78; t0,95; 5 = 2,57 ); X
; S là độ lệch chuẩn, được tính theo công thức (2.5); n là số phép đo.
2.4. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
2.4.1. Thiết bị
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Hitachi L-2000 với detector UV-VIS
- - Đại học Thái Nguyên.
- Máy quang phổ UV -
- Đại học Thái Nguyên, có khả năng quét phổ trong khoảng bước sóng 190nm - 900 nm, có kết nối máy tính.
- Bộ cuvet thạch anh.
- Cân điện tử có độ chính xác 0,0001g. - Bếp cách thủy.
- Máy rung siêu âm. - Máy đo pH.
2.4.2. Dụng cụ
- Pipet các loại: 1 mL; 2 mL; 5 mL; 10 mL; 20 mL; 25 mL: 50mL.
- Bình định mức: 10 mL; 25 mL; 50 mL; 100 mL; 250 mL; 500 mL; 1000 mL.
- Cốc thủy tinh, phễu thủy tinh, đũa thuy tinh, bình tia, ống nghiệm... - Chương trình lọc Kalman tính toán đồng thời nồng độ các cấu tử [18].
2.4.3. Hóa chất
- HCl, H2SO4, HNO3, H3PO4, KH2PO4, CH3CN... dùng để pha chế các dung dịch đều thuộc loại tinh khiết của Merck.
- Chất chuẩn paracetamol, clopheninamin maleat nguyên chất do viện kiểm nghiệm dược sản xuất.
- Thuốc viên COLDACMIN sản xuất bởi: DHG PHARMA Công ty cổ phần dược Hậu Giang 288 Bis, Nguyễn Văn Cừ, P. An Hòa, Q. Ninh Kiều, TP Cần Thơ. Số lô: 24-01-14; Ngày sản xuất: 20/1/2014; Hạn sử dụng: 20/1/2017.
Thành Phần:
Mỗi viên nén chứa: Paracetamol: 325 mg
Clopheninamin maleat: 4 mg
- Thuốc viên PACEMIN sản xuất bởi: Công ty
dược phẩm Hà Tây, La Kê, Hà Đông, TP Hà Nội. Số lô: 651014; Ngày sản xuất: 27/04/2014; Hạn sử dụng: 27/04/2017.
Thành Phần:
Mỗi viên nén chứa: Paracetamol: 325 mg
Clopheninamin maleat: 4 mg
, chúng tôi đã sử dụng các dung môi sau: - Dung dịch đệm KH2PO4 0,05M.
- Dung dịch pha loãng (gọi là dung dịch I). - Dung dịch pha mẫu (gọi là dung dịch II). - Dung dịch pha động.
- Dung dịch HCl 10-1M; 10-2M; 10-3M.
- Dung dịch H2SO4 5.10-2M; 5.10-3M; 5. 10-4M. - Dung dịch HNO3 10-1M; 10-2M; 10-3M.
Dung dịch đệm được chuẩn bị bằng cách hòa tan 2,04g Kali dihydrophotphatKH2PO4 trong 950mL nước cất 2 lần, thêm 2mL triethylamin sau đó lắc siêu âm trong 10 phút, định mức thành 1000mL. Độ pH của dung dịch được điều chỉnh bằng 2,5 với axit photphoric thu được hỗn hợp đệm.
Dung dịch pha loãng (dung dịch I) được pha bằng cách lấy dung dịch đệm KH PO và acetonitrile với tỷ lệ về thể tích là 1:1.
Dung dịch pha mẫu (dung dịch II) là hỗn hợp nước cất và dung dịch pha loãng với tỉ lệ về thể tích là 24 : 1.
Dung dịch pha động chuẩn bị bằng cách lấy đệm KH2PO4 và acetonitrile ở các tỷ lệ về thể tích từ 85:15 đến 95:5.
Lấy 41,8
0,001M.
Lấy 5,5 mL dung dịch H2SO4
100 mL thu được dung dịch H2SO4
H2SO4 0,05M; H2SO4 2SO4 0,0005M. Lấy 7 mL dung dịch HNO3
100 mL thu được dung dịch HNO3 HNO3 0,1M; 0,001M..
Các dung dịch HCl, H2SO4, HNO3 đã được kiểm tra lại nồng độ bằng chuẩn độ axit - bazơ.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phƣơng pháp HPLC
3.1.1. Xác định điều kiện tối ưu cho phép xác định PRC và CPM bằng phương pháp HPLC phương pháp HPLC
Qua việc nghiên cứu tính chất lý hóa của PRC và CPM kết hợp với tài liệu tham khảo và điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn kiểu sắc ký hấp phụ pha đảo (RP-HPLC), sử dụng cột silica C18, thể tích bơm mẫu là 20 µL, nhiệt độ 30o
C.
3.1.1.1. Khảo sát lựa chọn pha động
Để chọn được pha động thích hợp, chúng tôi đã tiến hành khảo sát tỉ lệ thành phần pha động là hỗn hợp đệm KH2PO4 : acetonitrile ở các tỷ lệ về thể tích lần lượt là: 85:15 cho đến 95:5 với tốc độ dòng là 1,0 mL/phút. Các dung dịch được lọc qua màng lọc 0,45 µm sau đó rung siêu âm để khử bọt khí.
Sự thay đổi tỉ lệ thành phần pha động làm thay đổi đáng kể kết quả sắc ký. Tuy nhiên tỷ lệ hỗn hợp đệm KH2PO4(pH=2,5) : acetonitrile 92:8 cho kết quả tốt nhất với thời gian lưu của PRC là 10,805giây và CPM là 4,71 giây
Vì vậy, chúng tôi chọn pha động để xác định đồng thời 2 chất là hỗn hợp đệm KH2PO4(pH=2,5): acetonitrile với tỷ lệ thể tích là 92:8
3.1.1.2. Lựa chọn bước sóng
Việc lựa chọn bước sóng dựa trên cơ sở các tài liệu tham khảo kết hợp với khảo sát thực nghiệm tại 2 bước sóng λ = 280 nm và λ = 215 nm.
Tại λ = 280 nm: là bước sóng tại đó PRC có độ hấp thụ quang cực tiểu CPM có độ hấp thụ quang trung bình. Tuy nhiên kết quả thực nghiệm cho thấy các pic của CPM hầu như không xuất hiện.
Tại λ = 215 nm: là bước sóng PRC có độ hấp thụ quang cực tiểu, CPM có độ hấp thụ quang cao. Kết quả thực nghiệm cho thấy đường nền thẳng, xuất hiện cả 2 pic với thời gian lưu phù hợp. Kết quả được thể hiện ở các hình 3.1, 3.2.
Hình 3.1. Sắc ký đồ của PRC (325 µg/mL)
Hình 3.2. Sắc ký đồ của CPM (10 µg/mL)
3.1.1.3. Lựa chọn tốc độ dòng
Để lựa chọn được tốc độ dòng thích hợp, chúng tôi tiến hành sắc ký với các điều kiện ở trên nhưng với các tốc độ dòng là 1 mL/phút, 1,5 mL/phút và 2 mL/phút.
Với tốc độ dòng 1,0 mL/phút, kết quả tách tốt, các pic tách rời nhau và thời gian chạy sắc ký phù hợp.
Với tốc độ dòng 1,5 mL/phút và 2 mL/phút, các pic có đỉnh nhọn và chân pic hẹp.
Vì vậy, chúng tôi lựa chọn tốc dộ dòng là 1,0 mL/phút để tiến hành phân tích sắc ký.
Kết luận chung: Từ các kết quả trên, chúng tôi lựa chọn điều kiện tối ưu cho phương pháp xác định đồng thời PRC, CPM là:
Pha động: hỗn hợp đệm KH2PO4(pH= 2,5): acetonitrile với tỷ lệ thể tích là 92:8. Detector UV-VIS: λ = 215 nm. Cột: sử dụng cột C18 (250mm x 4,6). Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút. Thể tích bơm mẫu: 20 µL. Nhiệt độ phân tích: 30o C.
Với các điều kiện trên, chúng tôi đã tiến hành phân tích và kết quả sắc ký được thể hiện ở hình 3.3.
Hình 3.3. Sắc ký đồ của CPM 4mg (1), PRC 500mg (2)
Kết quả phổ ở hình 3.3 cho thấy 2 pic đều được tách ra hoàn toàn, các pic gọn và cân đối, thời gian lưu của 2 chất là hợp lý với thời gian lưu của PRC là 10,805 phút, CPM là 4,710 phút.
3.1.2. Đánh giá phương pháp định lượng
3.1.2.1. Chuẩn bị dung dịch hỗn hợp chuẩn
Dung dịch PRC 1: Cân chính xác 50 mg PRC và hòa tan bằng dung dịch II, sau đó đem rung siêu âm trong 10 phút và định mức thành 50 mL. Thu được dung dịch PRC có nồng độ là 1000 µg/mL (gọi là dung dịch PRC 1). Pha loãng dung dịch PRC 1 bằng dung dịch II thu được các dung dịch PRC có nồng độ 800 µg/mL, 600 µg/mL, 400 µg/mL và 200 µg/mL.
Dung dịch CPM 1: Cân chính xác 50 mg CPM hòa tan bằng dung dịch II, sau đó đem rung siêu âm trong 10 phút, định mức thành 100mL thu được dung dịch CPM có nồng độ 500 µg/mL. Pha loãng bằng dung dịch II thu được dung dịch CPM có nồng độ là 25 µg/mL (gọi là dung dịch CPM 1). Tiếp tục pha loãng dung dịch CPM 1 bằng dung dịch II thu được các dung dịch CPM có nồng độ 8 µg/mL, 4 µg/mL, 2 µg/mL và 1 µg/mL.
Dung dịch hỗn hợp 1: lấy lần lượt 8,125 mL dung dịch PRC 1; 4 mL dung dịch CPM 1 cho vào bình định mức 25 mL và định mức bằng dung dịch II được dung dịch chuẩn có nồng độ: PRC : CPM = 325 : 4 (µg/mL).
Dung dịch hỗn hợp 2: lấy lần lượt 8,125 mL dung dịch PRC 1; 2 mL dung dịch CPM 1 cho vào bình định mức 25 mL và định mức bằng dung dịch II được dung dịch chuẩn có nồng độ: PRC : CPM = 325 : 2 (µg/mL).
Các dung dịch được lọc qua màng lọc 0,45 µm.
3.1.2.2. Kiểm tra tính thích hợp của hệ thống.
Để khảo sát tính thích hợp của hệ thống máy HPLC khi phân tích định lượng PRC, CPM. Chúng tôi tiến hành khảo sát các đại lượng đặc trưng như: số
đĩa lý thuyết, độ phân giải, thời gian lưu, diện tích pic qua việc bơm lặp lại 4 lần dung dịch chuẩn để sắc ký. Kết quả được chỉ ra ở bảng 3.1; 3.2 và 3.3.
Bảng 3.1. Giá trị các đại lượng đặc trưng
Hóa chất Số đĩa lý thuyết (N) Độ phân giải ( RS )
CPM 2142 9,18
PRC 2296
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát thời gian lƣu Lần
bơm
PRC CPM
Thời gian lƣu
(phút) Số liệu thống kê Thời gian
lƣu (phút) Số liệu thống kê
1 10,813 X = 10,805 S = 0,008 %RSD=0,07 4,697 X = 4,710 S = 0,010 %RSD= 0,228 2 10,798 4,723 3 10,810 4,710 4 10,799 4,713
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát diện tích pic Lần bơm PRC CPM Diện tích pic (mAu x phút) Số liệu thống kê Diện tích pic (mAu x phút) Số liệu thống kê 1 4608,9 X = 4607,4 S = 4,41 %RSD = 0,09 275,6 X = 274,9 S = 2,49 %RSD = 0,91 2 4612,1 272,1 3 4601,6 277,9 4 4606,8 273,8
Kết quả ở bảng 3.1, 3.2 và 3.3 cho thấy: các thông số hệ thống như số đĩa lý thuyết và độ phân giải nằm trong giới hạn cho phép. Chỉ số %RSD của diện
tích pic và thời gian lưu được tìm thấy đều nhỏ hơn 2%. Vì vậy hệ thống sắc ký đảm bảo tính thích hợp với 2 chất phân tích.
3.1.2.3. Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp
Độ tuyến tính được khảo sát trên dung dịch các chất chuẩn với các nồng độ khác nhau:
Các dung dịch PRC có nồng độ từ 200 - 800 µg/mL, CPM có nồng độ từ 1 - 8 µg/mL được pha loãng từ dung dịch PRC 1, CPM 1 bằng dung dịch II như ở mục 3.1.2.1.
Tiến hành chạy sắc ký lần lượt từng dung dịch theo điều kiện sắc ký đã chọn ở trên. Xác định được sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic bằng phương trình hồi quy tuyến tính và hệ số tương quan R2
.
Kết quả khảo sát độ tuyến tính của 2 chất được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Mối tƣơng quan giữa nồng độ và diện tích pic của PRC và CPM PRC
Dung dịch 1 2 3 4
Nồng độ (µg/mL) 200 400 600 800
Diện tích (mAuxphút) 1849,01 3596,14 5545,12 7354,32 Phương trình hồi quy tuyến tính: y = 1846,5x -30,08 với R2
= 0,9996
CPM
Dung dịch 1 2 3 4
Nồng độ (µg/mL) 1 3 5 7
Diện tích (mAuxphút) 145,41 416,23 676,09 958,97 Phương trình hồi quy tuyến tính: y = 270,05x - 125,96 với R2
Từ kết quả ở bảng 3.4. Biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic của PRC và CPM theo nồng độ. Kết quả được thể hiện ở hình 3.4 và 3.5.
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic của PRC và nồng độ
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic của CPM và nồng độ
3.1.2.4. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp sắc ký
Tiến hành khảo sát độ lặp lại của phương pháp với các dung dịch chuẩn PRC 350µg/mL; CPM 2 µg/mL; CPM 4 µg/mL (ở mục 3.2.1).
Đo các dung dịch trên trong điều kiện sắc ký đã chọn, so sánh diện tích pic của dung dịch chuẩn trong cùng điều kiện, kết quả được thể hiện ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ lặp lại
Mẫu PRC CPM(2) CPM(4) Diện tích pic (mAuxphút) Hàm lƣợng (µg/mL) Diện tích pic (mAuxphút) Hàm lƣợng (µg/mL) Diện tích pic (mAuxphút) Hàm lƣợng (µg/mL) Chuẩn 2987,69 325,00 270,97 2,00 541,38 4,00 1 2989,20 325,16 266,91 1,97 538,67 3,98 2 2986,57 324,88 269,62 1,99 534,61 3,95 3 2988,12 325,05 271,02 2,00 542,73 4,01 4 2981,52 324,33 272,32 2,01 540.03 3,99 Số liệu thống kê X = 324,86 S = 0,37 %RSD = 0,11 µ = 324,86 0,83 X = 1,99 S = 0,02 %RSD = 0,86 µ = 1,99 0,03 X = 3,98 S = 0,03 %RSD = 0,63 µ = 3,98 0,04
Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.5 cho thấy độ lệch chuẩn tương đối %RSD của cả 2 chất phân tích đều nhỏ hơn 2% (PRC: 0,11%; CPM(2): 0,86%; CPM(4): 0,63%) và sai số tương đối nhỏ. Như vậy, phương pháp sắc ký định lượng đồng thời cả 2 chất PRC và CPM có độ lặp lại cao.
3.1.3. Xác định PRC và CPM trong thuốc COLDACMIN
Cân chính xác 20 viên thuốc COLDACMIN (X= 0,3503g/viên; mỗi viên có chứa 325 mg PRC; 4 mg CPM) và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột thuốc tương đương với 65 mg PRC; 0,8 mg CPM cho vào bình định mức 100 mL sau đó hòa tan và định mức bằng dung dịch II và rung siêu âm
trong 15 phút ta được dung dịch chứa PRC 650 µg/mL; CPM 8 µg/mL. Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 µm. Pha loãng 2 lần dung dịch bằng dung dịch II thu được dung dịch chứa PRC 325µg/mL; CPM 4 µg/mL.
Đo các dung dịch trên trong điều kiện sắc ký đã chọn, dựa vào đường