Thuật toán lọc Kalman đầu tiên được nghiên cứu trong vật lý vô tuyến nhằm loại bỏ các tín hiệu "nhiễu" và sau đó được ứng dụng vào hoá học trắc quang. Thuật toán lọc Kalman hoạt động trên cơ sở các file dữ liệu phổ ghi được của từng cấu tử riêng rẽ và của hỗn hợp các cấu tử, xác định sự đóng góp về phổ của từng cấu tử trong hỗn hợp tại các bước sóng. Khi chương trình chạy, những kết quả tính toán liên tiếp sẽ càng tiến gần đến giá trị thực. Trong thực tế, người ta sử dụng phương pháp bình phương tối thiểu để giảm sai số giữa phổ của hỗn hợp với phổ nhân tạo được dự đoán bởi phương pháp lọc Kalman. Kết quả tính toán là lý tưởng khi phổ của hỗn hợp trừ đi phổ nhân tạo được tính bởi lọc Kalman sẽ tạo ra một đường thẳng có độ lệch không đáng kể. Độ đúng của phép xác định phụ thuộc vào độ nhiễu của nền, vào việc tách các đỉnh phổ hấp thụ của các cấu tử và sự tương tác giữa các cấu tử. Hỗn hợp có càng ít cấu tử, các đỉnh hấp thụ càng cách xa nhau thì sai số của phép tính toán sẽ càng nhỏ.
Việc tính toán sẽ được thực hiện trên toàn bộ khoảng bước sóng được chọn. Nếu kết thúc quá trình tính toán, độ lệch chuẩn tương đối của giá trị nồng độ các cấu tử trong hỗn hợp vẫn lớn hơn giá trị sai số cho phép thì nồng độ của cấu tử đó sẽ phải xác định lại. Khi đó, cần phải tăng giá trị sai số mặc định hoặc giảm số giá trị nồng độ mặc định để tính giá trị nồng độ trung bình.
1.1. Mô hình hoạt động của bộ lọc Kalman
Một số tác giả đã sử dụng thuật toán lọc Kalman để xác định các cấu tử trong hỗn hợp bằng phương pháp trắc quang. Kết quả cho thấy sai số của phép xác định với hỗn hợp 2 cấu tử nhỏ hơn 1%, với hỗn hợp 3 cấu tử có sai số nhỏ hơn 2% [ 10, 18, 19].
Tín hiệu đo Mạch lọc
kalman
Tín hiệu thu được
1.4. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Phương pháp này ra đời từ năm 1970 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. Khi đó nó có tên gọi là phương pháp sắc ký lỏng áp suất cao, ngày nay gọi là phương pháp sắc lý lỏng hiệu năng cao (HPLC). Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích. Nó áp dụng rất nhiều trong các ngành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm thuốc, máy phân tích HPLC là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng. Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt.
1.4.1. Nguyên tắc của phương pháp HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp phân tích hóa lý, quá trình tách chủ yếu dựa trên lực tương tác giữa chất phân tích với pha tĩnh và pha động.
- Pha tĩnh là pha không di chuyển thường nạp vào cột sắc ký, có tác dụng lưu giữ chất phân tích
- Pha động có nhiệm vụ chuyển chất phân tích dọc theo cột sắc ký với tốc độ thích hợp.
Chất phân tích bị lưu giữ trên pha tĩnh phụ thuộc ái lực của chúng.
Do ái lực hấp thu và giải hấp thu khác nhau của các hợp phần có trong mẫu phân tích với pha tĩnh và pha động mà chúng di chuyển dọc theo pha tĩnh (cột sắc ký) tốc độ khác nhau nên lần lượt đi ra khỏi cột.
Quá trình sắc ký là quá trình cân bằng động được thiết lập liên tục từ đầu đến cuối cột, hợp phần có ái lực hấp thu mạnh đẩy hợp phần có ái lực hấp thu yếu, dần dần chúng tách ra khỏi nhau.
Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột:
Trong phương pháp HPLC các kỹ thuật tách thường sử dụng: Sắc ký hấp phụ pha thường; sắc ký hấp phụ pha đảo; sắc ký trao đổi ion, sắc ký ion, sắc ký cặp ion và sắc ký rây phân tử.
- Sắc ký hấp phụ pha thường: Pha tĩnh hạt xốp, phân cực, pha động dung môi không phân cực hay ít phân cực, kỵ nước. Phương pháp được sử dụng tách các hợp chất hữu cơ không phân cực và ít phân cực có trong dung môi kỵ nước.
- Sắc ký hấp phụ pha đảo: Pha tĩnh là loại không phân cực, kỵ nước, pha động dung môi phân cực. Phương pháp sử dụng tách và phân tích các chất không phân cực, ít phân cực và phân cực.
- Sắc ký trao đổi ion: Pha tĩnh có cấu tạo ion, phân cực, pha động dung
dịch axít, bazơ, dung dịch đệm. Phương pháp sử dụng tách các chất dạng ion hoặc phân ly thành ion. Cơ chế tách theo phản ứng trao đổi ion.
- Sắc ký rây phân tử: Pha tĩnh loại mạng lưới phân tử có kích thước lỗ xác định, pha động dung môi hữu cơ. Phương pháp sử dụng trong lĩnh vực sinh học phân tử y sinh học, tách các chất theo kích thước phân tử .
+ Pha tĩnh trong kỹ thuật tách HPLC cũng giữ vai trò như kỹ thuật tách áp suất thường, nhưng về cấu tạo và kích thước khác nhiều. Pha tĩnh HPLC là loại hạt rắn, xốp, kích thước hạt rất nhỏ 3-10 m, thậm chí hiện nay đã xuất hiện loại nhỏ hơn 1,7 m, diện tích bề mặt 50-500m2
/g. * Yêu cầu đối với pha tĩnh:
- Phải trơ và bền vững với các điều kiện môi trường sắc ký và chất phân tích, pha động.
- Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất phân tích
- Có bề mặt ổn định, đặc biệt độ xốp, không thay đổi hay biến dạng trong quá trình sắc ký.
- Cân bằng động học xẩy ra nhanh và lặp lại tốt.
Thể tích xốp 0,5-2mL/g, diện tích bề mặt 80-500m2
/g.
+ Để rửa rải chất phân tích ra khỏi cột, ta cần có một pha động.
Pha động là dung môi để rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột sắc ký thực hiện quá trình tách. Pha động có thể một dung môi hữu cơ như metanol, axetonitril, bezen, hay hỗn hợp nước-dung môi hữu cơ. Có thể dung dịch nước axit, bazơ, dung dịch đệm, chất tạo phức. Pha động yếu tố thứ hai quyết định hiệu quả tách sắc ký. Hai yếu tố quyết định quá trình tách sắc ký là pha tĩnh và pha động.
*Pha động phải thỏa mãn các yêu cầu sau:
- Pha động phải trơ đối với pha tĩnh, không làm hỏng pha tĩnh, không tương tác phụ với pha tĩnh để sinh ra những sản phẩm khác làm phức tạp quá trình tách.
- Pha động phải hòa tan được chất mẫu để mẫu được vận chuyển tốt từ đầu cột tách đến cuối cột tách.
- Pha động phải bền vững theo thời gian, có thành phần khống chế được trong quá trình sắc ký. Không bị phân hủy khi chạy sắc ký.
- Pha động phải có độ tinh khiết cao để đảm bảo không làm nhiễm bẩn mẫu phân tích, gây sai số.
- Pha động phải nhanh chóng đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.
- Pha động phải phù hợp với detector, không làm hư hại tế bào dòng chảy của detector.
+ Nếu nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C... vào cột phân tích, kết quả là các chất A, B, C... sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột.
1.4.2. Các đại lượng đặc trưng của quá trình sắc kí
1.4.2.1. Thời gian lưu và thể tích lưu
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị nồng độ cực đại và cho ra pic trên sắc kí đồ.
Nếu gọi là thời gian lưu trữ của một chất thì:
Hình 1.2. Thời gian lưu của cấu tử phân tích
,
R
t = tR - t0
(1.12)
Trong đó: tR, : là thời gian lưu thực (thời gian lưu hiệu chỉnh).
0
t : là thời gian chết (thời gian không lưu trữ).
Trong cùng một điều kiện sắc kí đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian lưu khác nhau tùy thuộc vào bản chất, cấu tạo vào tính chất của chất đó. Vì vậy thời gian lưu là đại lượng định tính các chất.
Khi pha động chảy qua cột với một tốc độ không đổi thì thời gian lưu có thể thay thế bằng thể tích lưu. Thể tích lưu là thể tích pha động thu được sau cột trong khoảng thời gian tương ứng với thời gian lưu.
1.4.2.2. Hệ số phân bố
Trong quá trình sắc kí luôn có sự phân bố của chất tan giữa pha động và pha tĩnh. Sự phân bố này đặc trưng bởi cân bằng phân bố với hệ số phân bố được tính theo công thức sau:
K = (1.13) Trong đó : là nồng độ của chất phân tích tương ứng trong pha tĩnh
và pha động ở thời điểm cân bằng.
1.4.2.3. Thừa số dung lượng
Thừa số dung lượng là đại lượng biểu thị khả năng phân bố của chất tan trong hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỉ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng
= = K× (1.14)
Trong đó: , là lượng chất tan có trong pha tĩnh và pha động. , là thể tích pha tĩnh và pha động. Có thể tính theo công thức khác: = 0 t tR 1.4.2.4. Hệ số chọn lọc
Hai chất chỉ được tách ra khi chúng có giá trị k' khác nhau, hệ số chọn lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc kí.
α = = = = (1.15)
Ở đây ta quy ước chất B bị lưu giữ mạnh hơn chất A như vậy luôn lớn hơn 1, càng lớn thì khả năng tách của 2 chất càng rõ. Thường phân tích trong điều kiện trong khoảng 1,5 đến 2.
1.4.2.5. Số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết
Hiệu lực cột thường biểu thị qua hai thông số: Số đĩa lý thuyết (N) hoặc chiều cao đĩa lý thuyết (H). Cột sắc ký được coi như có N tầng lý thuyết, ở mỗi tầng sự phân bố chất tan vào 2 pha lại đạt đến một trạng thái cân bằng mới. Mỗi tầng được giả định như một lớp pha tĩnh có chiều cao H. Đĩa lý thuyết được định nghĩa như một khu vực của hệ thống phân tách mà trong đó thiết lập một cân bằng nhiệt động giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và trong pha động.
Số đĩa lý thuyết N được tính theo các công thức:
N = 16× hoặc 5,54× (1.16)
Trong đó: W là chiều rộng pic ở đáy pic
là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của pic Chiều cao của đĩa lý thuyết được tính theo công thức:
H=
N L
(1.17) Trong đó: L là chiều cao cột sắc kí.
Với một điều kiện sắc kí nhất định, chiều cao đĩa lý thuyết (H) và số đĩa lý thuyết (N) là hằng định đối với mỗi chất phân tích.
1.4.2.6. Độ phân giải (RS)
Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trong điều kiện sắc kí đã cho. Độ phân giải của hai pic cạnh tranh được tính theo 1 trong 3 công thức sau:
=
hoặc ×
(1.18) Trong đó:
, : thời gian lưu tương ứng của chất A, chất B.
, : Chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic của chất A, chất B. , : Chiều rộng pic ở đáy pic.
α: Hệ số chọn lọc.
1.4.2.7. Hệ số đối xứng (T)
Cho biết mức độ cân đối của pic sắc kí, nó được tính theo công thức: T =
A Wx
2 (1.19)
Trong đó: Wx là độ rộng đáy pic đo ở 1/20 chiều cao của pic.
A là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ cực đại của pic đến chân đường cong phía trước, ở tại 1/20 chiều cao pic.
1.4.3. Sơ đồ máy HPLC
Hình 1.3. Hệ thống máy HPLC
Hệ thống máy HPLC có các bộ phận chính sau: 1.Bình chứa dung môi (pha động).
2.Bộ khử khí.
3.Bơm cao áp: Bơm cao áp để bơm pha động vào cột tách. Bơm có khả năng điều chỉnh được áp suất (0-400bar) để tạo tốc độ nhất định cho pha động qua cột sắc ký.
4.Bộ tiêm mẫu: tiêm vào cột một thể tích mẫu nhất định.
5.Cột tách (pha tĩnh): Chiều dài dao động từ 10-30cm, đường kính 2- 5mm. Có thể xem cột sắc ký như trái tim của qúa trình sắc ký, yếu tố quyết định quá trình tách một hỗn hợp.
6. Detector: đây là thiết bị chuyển tín hiệu không điện thành tín hiệu điện. 7.Máy ghi tín hiệu hoặc máy vi tính: ghi kết quả dạng pic.
8.Máy in. 1 2 3 4 5 6 7 8
1.4.4. Kết quả xác định một số chất theo phương pháp HPLC
Hiện nay ở nước ta, phương pháp HPLC được ứng dụng nhiều trong phân tích các chế phẩm về dược cũng như hỗn hợp các chất vô cơ, hữu cơ. Các kết quả đều cho thấy phương pháp có độ tin cậy cao.
Phương pháp định lượng đồng thời paracetamol và axit mefenamic: phương pháp có độ chính xác cao (sai số tương đối 0,51% - 1,42%), độ đúng tốt (tỷ lệ thu hồi 98,16% - 99,16%) [16].
Phương pháp định tính và định lượng đồng thời paracetamol và ibuprofen: phương pháp có độ lặp lại tốt (sai số tương đối 0,81% - 1,03%), độ đúng cao (tỷ lệ thu hồi 98,0% - 98,4%) [16].
Phương pháp định lượng đồng thời paracetamol và cafein: phương pháp có độ lặp lại tốt (sai số tương đối 0,54% - 1,07%), độ đúng cao (tỷ lệ thu hồi 98,9% - 99,5%) [16].
Phương pháp định lượng đồng thời paracetamol, phenylpropanolamin hidroclorit và clorphenylamin maleat: phương pháp có độ lặp lại cao (sai số tương đối của paracetamol là 0,47%; phenylpropanolamin hidroclorid là 0,67% và clophenylamin maleat là 1,19%), độ đúng cao (tỷ lệ thu hồi 99,61% - 100,65%) [16].
Chƣơng 2 THỰC NGHIỆM
2.1. Nội dung nghiên cứu
Áp dụng phương pháp sắc khí lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV-VIS) để xây dựng quy trình xác định đồng thời PRC, CPM trong thuốc COLDACMIN và PACEMIN trên thị trường.
2.1.1. Phương pháp HPLC
Lựa chọn các thông số của máy HPLC: - Thể tích bơm mẫu.
- Cột tách. - Nhiệt độ.
Khảo sát để lựa chọn các điều kiện sắc ký:
- Bước sóng thích hợp để phát hiện đồng thời 2 chất. - Pha động: thành phần, tỷ lệ pha động, tốc độ dòng... Đánh giá quy trình sắc ký đã xây dựng được:
- Khảo sát tính thích hợp của hệ thống.
- Khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất. - Khảo sát độ chính xác của phương pháp.
- Khảo sát độ đúng của phương pháp.
Xác định đồng thời PRC, CPM trong thuốc COLDACMIN và PACEMIN theo phương pháp HPLC.
2.1.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử
- Khảo sát trên toàn phổ từ 200 nm đến 300
PRC và CPM
- Tiến hành kiểm tra phổ hấp thụ phân tử của PRC và CPM trong các
dung môi có pH = 1 đến 4 để lựa chọn .
- Kiểm tra sự ổn định độ hấp thụ quang của PRC và CPM theo thời gian, nhiệt độ để lựa chọn khoảng thời gian và nhiệt độ thíc
- Khảo sát khoảng tuyến tính của PRC và CPM từ đó xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).
- PRC và CPM
PRC và CPM .
- Định lượng đồng thời PRC, CPM trong mẫu thuốc COLDACMIN và PACEMIN Đánh giá độ tin cậy của phương pháp t
hồi [ 5, 8, 9].
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Nghi
[3, 12, 28].
2.2.2.1. Phương pháp HPLC
Nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho phương pháp HPLC để định lượng đồng thời PRC và CPM.
Xử lý thống kê các kết quả thu được.
X và CPM trong thuốc COLDACMIN và
PACEMIN theo phương pháp HPLC.
2.2.2.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử
PRC và CPM
- .
- 2 COLDACMIN
- 2 ACEMIN
2.3. Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích 2.3.1. Giới hạn phát hiện (LOD) 2.3.1. Giới hạn phát hiện (LOD)