Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp phân tích hóa lý, quá trình tách chủ yếu dựa trên lực tương tác giữa chất phân tích với pha tĩnh và pha động.
- Pha tĩnh là pha không di chuyển thường nạp vào cột sắc ký, có tác dụng lưu giữ chất phân tích
- Pha động có nhiệm vụ chuyển chất phân tích dọc theo cột sắc ký với tốc độ thích hợp.
Chất phân tích bị lưu giữ trên pha tĩnh phụ thuộc ái lực của chúng.
Do ái lực hấp thu và giải hấp thu khác nhau của các hợp phần có trong mẫu phân tích với pha tĩnh và pha động mà chúng di chuyển dọc theo pha tĩnh (cột sắc ký) tốc độ khác nhau nên lần lượt đi ra khỏi cột.
Quá trình sắc ký là quá trình cân bằng động được thiết lập liên tục từ đầu đến cuối cột, hợp phần có ái lực hấp thu mạnh đẩy hợp phần có ái lực hấp thu yếu, dần dần chúng tách ra khỏi nhau.
Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột:
Trong phương pháp HPLC các kỹ thuật tách thường sử dụng: Sắc ký hấp phụ pha thường; sắc ký hấp phụ pha đảo; sắc ký trao đổi ion, sắc ký ion, sắc ký cặp ion và sắc ký rây phân tử.
- Sắc ký hấp phụ pha thường: Pha tĩnh hạt xốp, phân cực, pha động dung môi không phân cực hay ít phân cực, kỵ nước. Phương pháp được sử dụng tách các hợp chất hữu cơ không phân cực và ít phân cực có trong dung môi kỵ nước.
- Sắc ký hấp phụ pha đảo: Pha tĩnh là loại không phân cực, kỵ nước, pha động dung môi phân cực. Phương pháp sử dụng tách và phân tích các chất không phân cực, ít phân cực và phân cực.
- Sắc ký trao đổi ion: Pha tĩnh có cấu tạo ion, phân cực, pha động dung
dịch axít, bazơ, dung dịch đệm. Phương pháp sử dụng tách các chất dạng ion hoặc phân ly thành ion. Cơ chế tách theo phản ứng trao đổi ion.
- Sắc ký rây phân tử: Pha tĩnh loại mạng lưới phân tử có kích thước lỗ xác định, pha động dung môi hữu cơ. Phương pháp sử dụng trong lĩnh vực sinh học phân tử y sinh học, tách các chất theo kích thước phân tử .
+ Pha tĩnh trong kỹ thuật tách HPLC cũng giữ vai trò như kỹ thuật tách áp suất thường, nhưng về cấu tạo và kích thước khác nhiều. Pha tĩnh HPLC là loại hạt rắn, xốp, kích thước hạt rất nhỏ 3-10 m, thậm chí hiện nay đã xuất hiện loại nhỏ hơn 1,7 m, diện tích bề mặt 50-500m2
/g. * Yêu cầu đối với pha tĩnh:
- Phải trơ và bền vững với các điều kiện môi trường sắc ký và chất phân tích, pha động.
- Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất phân tích
- Có bề mặt ổn định, đặc biệt độ xốp, không thay đổi hay biến dạng trong quá trình sắc ký.
- Cân bằng động học xẩy ra nhanh và lặp lại tốt.
Thể tích xốp 0,5-2mL/g, diện tích bề mặt 80-500m2
/g.
+ Để rửa rải chất phân tích ra khỏi cột, ta cần có một pha động.
Pha động là dung môi để rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột sắc ký thực hiện quá trình tách. Pha động có thể một dung môi hữu cơ như metanol, axetonitril, bezen, hay hỗn hợp nước-dung môi hữu cơ. Có thể dung dịch nước axit, bazơ, dung dịch đệm, chất tạo phức. Pha động yếu tố thứ hai quyết định hiệu quả tách sắc ký. Hai yếu tố quyết định quá trình tách sắc ký là pha tĩnh và pha động.
*Pha động phải thỏa mãn các yêu cầu sau:
- Pha động phải trơ đối với pha tĩnh, không làm hỏng pha tĩnh, không tương tác phụ với pha tĩnh để sinh ra những sản phẩm khác làm phức tạp quá trình tách.
- Pha động phải hòa tan được chất mẫu để mẫu được vận chuyển tốt từ đầu cột tách đến cuối cột tách.
- Pha động phải bền vững theo thời gian, có thành phần khống chế được trong quá trình sắc ký. Không bị phân hủy khi chạy sắc ký.
- Pha động phải có độ tinh khiết cao để đảm bảo không làm nhiễm bẩn mẫu phân tích, gây sai số.
- Pha động phải nhanh chóng đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.
- Pha động phải phù hợp với detector, không làm hư hại tế bào dòng chảy của detector.
+ Nếu nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C... vào cột phân tích, kết quả là các chất A, B, C... sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột.