A. 25 Tính kết quả
A.6.2 Phương pháp tiến hành
Pha loãng mẫu thành các nồng độ khác nhau tùy theo lượng vi sinh có trong mẫu, mỗi nồng độ cách nhau 10 lần. Đối với sản phẩm đồ hộp tiến hành trên hai nồng độ pha loãng 10-1, 10-2.
Dùng pipette vô trùng cho 1 ml mẫu vào đĩa petri vô trùng(mỗi nồng độ cấy 2 đĩa), sau đó cho tiếp khoảng 15 - 17 ml môi trường PCA đã được làm nguội xuống 450C, lắc đều bằng cách xoay tròn đĩa theo chiều kim đồng hồ và
48
ngược chiều kim đồng hồ (mỗi chiều 5 lần) để trộn đều vi sinh vật. Để nguội và đem đi ủ ở 370C trong 48 giờ.
Chọn các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 25 250 để đếm
Lưu ý:
Trong quá trình thực hiện các dụng cụ cần được khử trùng tránh nhiễm vào mẫu phân tích.
Đĩa petri trước khi cấy được xử lý bằng cách thanh trùng ơ 1210C trong 30 phút.
Môi trường PCA, nước muối sinh lý được thanh trùng ở 1210C trong 15 phút
A.6.3 Tính kết quả
A = (số KLTB độ pha loãng 1 + số KLTB độ pha loãng 2 + ... + số KLTB độ pha loãng n)/n (cfu/n)
A: số khuẩn lạc trong một đơn vị mẫu. N: số khuẩn lạc pha loãng (1,2,3...)
Số KLTB độ pha loãng: B = (((a+b+c+....+n)/n)/D)*10 (cfu/ml) B: số khuẩn lạc
A,b,c,....,n: số khuẩn lạc của các lần lặp lại. D: độ pha loãng (10-1, 10-2,...)
Lưu ý:
Kết quả số khuẩn lạc sau khi tính phải được làm tròn đến 2 con số có nghĩa. Chỉ áp dụng khi xác định vi sinh vật hiếu khí. Khi làm tròn số, nâng chữ số thứ hai lên số có giá trị cao hơn khi số thứ ba lớn hơn hoặc bằng 5 và thay các số lẻ bằng số 0. Nếu chữ số thứ ba nhỏ hơn hoặc bằng 4, thay nó bằng số 0 và giữ nguyên số thứ hai.
Đối với những trường hợp bất thường (không đĩa nào trong cặp đĩa hoặc chỉ một đĩa có số đếm thích hợp...) có thể đếm và ghi nhận kết quả theo hướng dẫn sau (FDA 1984)
Hai đĩa có số đếm dưới 25
Đếm số khuẩn lạc thực có trên mỗi đĩa cấy cùng nồng độ đó, tính số khuẩn lạc trung bình cho mỗi đĩa và nhân với số lần pha loãng để có được ước
49
định của tổng số vi sinh vật hiếu khí. Đánh dấu kết quả bằng dấu (*) để biết rằng đó là kết quả ước định tính từ những đĩa nằm ngoài ngưỡng 25 - 250.
Hai đĩa có số đếm trên 250
Đếm số khuẩn lạc trên vài vùng đại diện cho số khuẩn lạc của đĩa (1/4, 1/6,... diện tích đĩa) rồi quy ra cho diện tích toàn đĩa. Giá trị trung bình của hai đĩa được gi nhận như tổng số vi sinh vật hiếu khí ước định. Đánh dấu (*) để biết rằng đó là kết quả ước định tính từ những đĩa nằm ngoài ngưỡng 25 - 250.
Dạng mọc lan
Các dạng mọc lan thường thuộc ba loại khác nhau.
(1) Một chuỗi khuẩn lạc không tách rời hẳn khỏi nhau như được tạo nên bởi sự phân tách của một cụm vi sinh vật
(2) Dạng mọc lan trong lớp nước mỏng giữa thạch và đáy đĩa. (3) Dạng mọc lan trong lớp nước mỏng ở rìa hoặc trên mặt thạch. Nếu các đĩa cấy có dạng mọc lan phát triển nhiều trên mức: a) vùng mọc lan (kể cả vùng mà sự phát triển bị kìm hãm) vượt quá 50% diện tích đĩa; b) vùng mà sự phát triển bị kìm hãm vượt quá 25% diện tích đĩa đều được ghi nhận là đĩa mọc lan. Xác định số đếm trung bình cho mỗi nồng độ, ghi nhận trung bình số học của các giá trị này như tổng số vi sinh vật hiếu khí.
Khi cần phải đếm những đĩa chứa dạng mọc lan không bị loại bởi kiểu a và b nói trên, đếm mỗi dạng mọc lan thuộc 3 kiểu trên như từ một nguồn. Đối với kiểu 1, nếu chỉ một chuỗi thì đếm như 1 khuẩn lạc đơn. Nếu có 1 hay vài chuỗi có vẻ như phát triển từ những nguồn khác nhau thì đếm mỗi nguồn như 1 khuẩn lạc riêng biệt. Không được đếm mỗi nhóm sinh trưởng riêng biệt trong một chuỗi kiểu này như một khuẩn lạc tách rời. Dạng 2 và 3 thường sinh ra những khuẩn lạc tách rời và được đếm như những khuẩn lạc riêng biệt. Kết hợp các số đếm từ dạng mọc lan và số đếm khuẩn lạc để tính tổng số vi sinh vật hiếu khí.
Đĩa không có khuẩn lạc
Khi trên các đĩa từ mọi nồng độ pha loãng đều không có khuẩn lạc nào, ghi kết quả tổng số vi sinh vật ít hơn 1 lần nồng độ pha loãng thấp nhất đã được sử dụng. Đánh dấu (*) để biết kết quả này là ước định do số đếm nằm ngoài ngưỡng 25 - 250.
50
Đếm cả hai đĩa, dùng cả kết quả đĩa có số khuẩn lạc quá 250 để tính tổng số vi sinh vật hiếu khí.
Hai nồng độ đếm được, mỗi nồng độ có 1 đĩa nằm ngoài ngưỡng 25 - 250
Khi 1 đĩa của 1 nồng độ nằm trong ngưỡng 25 - 250, đĩa thứ hai có dưới 25 hoặc 250 khuẩn lạc, đếm cả 4 đĩa và dùng cả 4 số đếm để tính tổng số vi sinh vật hiếu khí.
Hai nồng độ đếm được, một nồng độ có 2 đĩa trong ngưỡng, một nồng độ chỉ có một đĩa trong ngưỡng 25 - 250.
Khi cả 2 đĩa của 1 nồng độ chứa 25 - 250 khuẩn lạc và chỉ 1 đĩa của nồng độ khác chứa 25 - 250 khuẩn lạc, đếm cả 4 đĩa và dùng kết quả của cả đĩa dưới 25 lẫn đĩa trên 250 khuẩn lạc để tính tổng số vi sinh vật hiếu khí.
51
PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ THỐNG KÊ