A. 25 Tính kết quả
A.3 Phương pháp phân tích hàm lượng tro
A.3.1 Nguyên tắc
khi đốt và nung mẫu ở nhiệt độ rất cao, các chất hữu cơ có trong mẫu sẽ bị oxy hóa thành những chất bay hơi CO2, N2 và hơi nước, phần vô cơ còn lại chính là tro. Quá trình này hoàn tất khi có màu trắng hoặc xám.
A.3.2 Các bước tiến hành
Lấy cốc chứa mẫu khô sau khi phân tích ẩm độ đặt lên bếp điện đốt ở nhiệt độ cao 250 – 2700C đến khi không còn thấy khói.
Cho cốc vào trong tủ nung, mở nhiệt độ 5600C trong 4 giờ (đến khi mẫu có màu trắng hoặc xám).
Tắt tủ nung khoảng 30 phút để cho nhiệt độ hạ xuống mới lấy mẫu ra và đem cân (W3). A.3.3 Tính kết quả % Tro = 3 *100 d m T W
A.4 Đạm thô theo TCVN 3705-90 (phương pháp Kjeldahl)A.4.1 Nguyên tắc A.4.1 Nguyên tắc
Ở nhiệt độ cao, dưới tác dụng của H2SO4 đậm đặc và có chất xúc tác, các hợp chất hữu cơ bị oxy hóa, carbon và hydro tạo thành CO2 và H2O, còn gốc amin thì bị oxy hóa và giải phóng ra NH3, NH3 tác dụng với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch. Đây là giai đoạn công phá đạm trong mẫu.
44
Trong quá trình chưng cất, (NH4)2SO4 tác dụng với NaOH dư và giải phóng ra NH3
NH3 sinh ra sẽ được hấp thụ bằng dung dịch axit boric tạo thành tetraborat amon. Sau đó chuẩn độ dung dịch tetraborat amon bằng dung dịch chuẩn H2SO4, NH3 được giải phóng và xác định được lượng nitơ, theo các phản ứng sau:
Tính được % nitơ có trong mẫu nhân với 6,25 sẽ suy ra được % protein thô. Tỉ số này tùy thuộc vào tỉ lệ của các hợp chất nitơ có trong protein, nói cách khác là tùy thuộc vào nguồn gốc của protein (ví dụ: protein trong sữa: 6,38; ngũ cốc: 5,9; gelatin: 5,55; hạt có dầu: 5,4). Tuy nhiên, người ta thường dùng chỉ số chung là 6,25)
A.4.2 Các bước tiến hành Công phá đạm Công phá đạm
Cân 0.2 – 0.25g mẫu trên giấy nhôm, sau đó cho vào ống nghiệm Kjeldahl, đặt ống vào trong kệ nhôm.
Cho vào ống lần lượt 10 ml H2O2 và 10 ml H2SO4 đậm đặc, để yên 5 phút.
Đặt cả kệ nhôm vào trong bộ phận công phá đạm. Mở vòi nước và bật máy. Chỉnh nhiệt độ ở các mức: 1100C trong 20 phút 2000C trong 20 phút 3000C trong 20 phút 3700C trong 20 phút 2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 (1) (2) (NH4)2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2NH3 + H2O (3) NH3 + H2O NH4OH + H+ (4) 2NH4OH + 4H3BO4 (NH4)2B4O7 + 7H2O (5) (NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H2O (NH4)2SO4 + 4H3BO4
45
Tắt máy, khoảng 30 phút sau tắt nước, lấy kệ đỡ ra và chờ nguội hẳn. Nếu dung dịch trong ống nghiệm trong suốt thì quá trình công phá đạm xảy ra hoàn toàn, nếu còn màu vàng hay nâu thì thêm 5 ml H2O2 và lặp lại bước 3.
Chưng cất
Bật máy, kiểm tra NaOH, nước cất trước khi chưng cất.
Đặt ống nghiêm chứa dung dịch đã công phá đạm (NH4)2SO4 vào đúng vị trí ở hệ thống chưng cất đạm.
Bên dưới hệ thống chưng cất, đặt bình tam giác chứa 10 ml dung dịch axit boric 2%.
Xả NaOH từ bình chứa xuống 1 vạch. Đợi khi xuất hiện chữ P thì bấm nut RUN.
Máy chạy khoảng 5 phút, khi xuất hiện chữ “END” thì tắt. Dung dịch trong bình tam giác lúc này có màu hồng hay xanh, thông thường là màu xanh.
Chuẩn độ
Cho từng giọt dung dịch H2SO4 0.1N từ ống buret vào bình tam giác và lắc đều, nhẹ đến khi dung dịch vừa chuyển sang màu hồng nhạt thì dừng lại. Ghi thể tích dung dịch H2SO4 0.1N vừa chuẩn độ.
A.4.3 Tính kết quả%N = ( 0)*0.0014*100 %N = ( 0)*0.0014*100 m V V (mẫu ướt) %N = *100 % * 0014 . 0 * ) ( 0 Dr m V V (mẫu khô) %CP = %N * 6.25 Trong đó: %CP: % protein thô V0: Thể tích H2SO4 0.1N chuẩn độ mẫu trắng
V: Thể tích H2SO4 0.1N chuẩn độ mẫu đang phân tích m: Trọng lượng mẫu
46
A.5 Lipid (Phương pháp Soxhlet (TCVN 3703 – 90)
A.5.1 Nguyên lý
Dựa trên khả năng hòa tan của lipid trong dung môi hữu cơ không phân cực, dùng dung môi hữu cơ để trích lipid trong nguyên liệu đã được nghiền nhỏ. Từ đó xác định được hàm lượng lipid trong mẫu phân tích.
A.5.2 Dụng cụ và hóa chấtỐng pancol 50ml, 15ml Ống pancol 50ml, 15ml Cân điện tử Máy lắc ngang Máy ly tâm Tủ sấy Và một số dụng cụ khác trong phòng thí nghiệm Petroleum ether
A.5.3 Các bước tiến hành
Ống pancol lớn (50ml) rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ 600C (12 – 24 giờ),sau đó sấy ở 1050C trong 2 giờ cho vào bình hút ẩm (30 phút) rồi cân (W1).
Cân 0,5g mẫu (±0,1) cho vào ống pancol nhỏ (15ml) (m).
Ly trích lần 1: cho 10 - 12ml petroleum ether vào ống pancol 15ml. Đem mẫu lắc ngang (300 vòng trong 2 giờ), sau đó đặt vào máy ly tâm (4000 vòng trong15 phút). Hút dịch trong cho vào ống pancol lớn đã biết khối lượng.
Ly trích lần 2: Tiếp tục cho 10 - 12ml petroleum ether vào ống pancol 15ml. Sau đó lắc ngang (300 vòng trong 15 phút), sau đó đặt vào máy ly tâm (4000 vòng trong15 phút). Hút dịch trong cho vào ống pancol lớn đã biết khối lượng.
Ly trích lần 3: Tương tự như lần 2.
Cho ống pancol lớn đã chứa dung dịch của 3 lần ly trích vào tủ sấy ở 600C (24 - 48 giờ), sau đó sấy ở 1050C trong 2 giờ. Sau khi sấy xong cho vào bình hút ẩm 30 phút cân nóng xác định khối lượng (W2). (lưu ý: cân đến khi khối lượng ổn định)
47 Công thức tính: % Lipid = 2 1*100 m W W (mẫu ướt) % Lipid = *100 % * 1 2 Dr m W W (mẫu khô) Trong đó:
m: khối lượng mẫu (g) W1: ông pancol (50ml) (g)
W2 : ông pancol (50ml) + lipid (g)
%Dr = 100 - % Độ ẩm
A.6 Phương pháp đếm tổng vi khuẩn hiếu khí A.6.1 Thiết bị và vật liệu A.6.1 Thiết bị và vật liệu
Dụng cụ Nồi thanh trùng Tủ ấm Bể ổn nhiệt Đĩa petri Pipette 1ml
Đèn cồn, cốc 100ml và các dụng cụ cần thiết cho nghiên cứu vi sinh khác.
Hóa chất: cồn, nước muối sinh lý. Môi trường: Plate count agar. (PCA). Mẫu vật: mẫu cần kiểm tra vi sinh.
A.6.2 Phương pháp tiến hành
Pha loãng mẫu thành các nồng độ khác nhau tùy theo lượng vi sinh có trong mẫu, mỗi nồng độ cách nhau 10 lần. Đối với sản phẩm đồ hộp tiến hành trên hai nồng độ pha loãng 10-1, 10-2.
Dùng pipette vô trùng cho 1 ml mẫu vào đĩa petri vô trùng(mỗi nồng độ cấy 2 đĩa), sau đó cho tiếp khoảng 15 - 17 ml môi trường PCA đã được làm nguội xuống 450C, lắc đều bằng cách xoay tròn đĩa theo chiều kim đồng hồ và
48
ngược chiều kim đồng hồ (mỗi chiều 5 lần) để trộn đều vi sinh vật. Để nguội và đem đi ủ ở 370C trong 48 giờ.
Chọn các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 25 250 để đếm
Lưu ý:
Trong quá trình thực hiện các dụng cụ cần được khử trùng tránh nhiễm vào mẫu phân tích.
Đĩa petri trước khi cấy được xử lý bằng cách thanh trùng ơ 1210C trong 30 phút.
Môi trường PCA, nước muối sinh lý được thanh trùng ở 1210C trong 15 phút
A.6.3 Tính kết quả
A = (số KLTB độ pha loãng 1 + số KLTB độ pha loãng 2 + ... + số KLTB độ pha loãng n)/n (cfu/n)
A: số khuẩn lạc trong một đơn vị mẫu. N: số khuẩn lạc pha loãng (1,2,3...)
Số KLTB độ pha loãng: B = (((a+b+c+....+n)/n)/D)*10 (cfu/ml) B: số khuẩn lạc
A,b,c,....,n: số khuẩn lạc của các lần lặp lại. D: độ pha loãng (10-1, 10-2,...)
Lưu ý:
Kết quả số khuẩn lạc sau khi tính phải được làm tròn đến 2 con số có nghĩa. Chỉ áp dụng khi xác định vi sinh vật hiếu khí. Khi làm tròn số, nâng chữ số thứ hai lên số có giá trị cao hơn khi số thứ ba lớn hơn hoặc bằng 5 và thay các số lẻ bằng số 0. Nếu chữ số thứ ba nhỏ hơn hoặc bằng 4, thay nó bằng số 0 và giữ nguyên số thứ hai.
Đối với những trường hợp bất thường (không đĩa nào trong cặp đĩa hoặc chỉ một đĩa có số đếm thích hợp...) có thể đếm và ghi nhận kết quả theo hướng dẫn sau (FDA 1984)
Hai đĩa có số đếm dưới 25
Đếm số khuẩn lạc thực có trên mỗi đĩa cấy cùng nồng độ đó, tính số khuẩn lạc trung bình cho mỗi đĩa và nhân với số lần pha loãng để có được ước
49
định của tổng số vi sinh vật hiếu khí. Đánh dấu kết quả bằng dấu (*) để biết rằng đó là kết quả ước định tính từ những đĩa nằm ngoài ngưỡng 25 - 250.
Hai đĩa có số đếm trên 250
Đếm số khuẩn lạc trên vài vùng đại diện cho số khuẩn lạc của đĩa (1/4, 1/6,... diện tích đĩa) rồi quy ra cho diện tích toàn đĩa. Giá trị trung bình của hai đĩa được gi nhận như tổng số vi sinh vật hiếu khí ước định. Đánh dấu (*) để biết rằng đó là kết quả ước định tính từ những đĩa nằm ngoài ngưỡng 25 - 250.
Dạng mọc lan
Các dạng mọc lan thường thuộc ba loại khác nhau.
(1) Một chuỗi khuẩn lạc không tách rời hẳn khỏi nhau như được tạo nên bởi sự phân tách của một cụm vi sinh vật
(2) Dạng mọc lan trong lớp nước mỏng giữa thạch và đáy đĩa. (3) Dạng mọc lan trong lớp nước mỏng ở rìa hoặc trên mặt thạch. Nếu các đĩa cấy có dạng mọc lan phát triển nhiều trên mức: a) vùng mọc lan (kể cả vùng mà sự phát triển bị kìm hãm) vượt quá 50% diện tích đĩa; b) vùng mà sự phát triển bị kìm hãm vượt quá 25% diện tích đĩa đều được ghi nhận là đĩa mọc lan. Xác định số đếm trung bình cho mỗi nồng độ, ghi nhận trung bình số học của các giá trị này như tổng số vi sinh vật hiếu khí.
Khi cần phải đếm những đĩa chứa dạng mọc lan không bị loại bởi kiểu a và b nói trên, đếm mỗi dạng mọc lan thuộc 3 kiểu trên như từ một nguồn. Đối với kiểu 1, nếu chỉ một chuỗi thì đếm như 1 khuẩn lạc đơn. Nếu có 1 hay vài chuỗi có vẻ như phát triển từ những nguồn khác nhau thì đếm mỗi nguồn như 1 khuẩn lạc riêng biệt. Không được đếm mỗi nhóm sinh trưởng riêng biệt trong một chuỗi kiểu này như một khuẩn lạc tách rời. Dạng 2 và 3 thường sinh ra những khuẩn lạc tách rời và được đếm như những khuẩn lạc riêng biệt. Kết hợp các số đếm từ dạng mọc lan và số đếm khuẩn lạc để tính tổng số vi sinh vật hiếu khí.
Đĩa không có khuẩn lạc
Khi trên các đĩa từ mọi nồng độ pha loãng đều không có khuẩn lạc nào, ghi kết quả tổng số vi sinh vật ít hơn 1 lần nồng độ pha loãng thấp nhất đã được sử dụng. Đánh dấu (*) để biết kết quả này là ước định do số đếm nằm ngoài ngưỡng 25 - 250.
50
Đếm cả hai đĩa, dùng cả kết quả đĩa có số khuẩn lạc quá 250 để tính tổng số vi sinh vật hiếu khí.
Hai nồng độ đếm được, mỗi nồng độ có 1 đĩa nằm ngoài ngưỡng 25 - 250
Khi 1 đĩa của 1 nồng độ nằm trong ngưỡng 25 - 250, đĩa thứ hai có dưới 25 hoặc 250 khuẩn lạc, đếm cả 4 đĩa và dùng cả 4 số đếm để tính tổng số vi sinh vật hiếu khí.
Hai nồng độ đếm được, một nồng độ có 2 đĩa trong ngưỡng, một nồng độ chỉ có một đĩa trong ngưỡng 25 - 250.
Khi cả 2 đĩa của 1 nồng độ chứa 25 - 250 khuẩn lạc và chỉ 1 đĩa của nồng độ khác chứa 25 - 250 khuẩn lạc, đếm cả 4 đĩa và dùng kết quả của cả đĩa dưới 25 lẫn đĩa trên 250 khuẩn lạc để tính tổng số vi sinh vật hiếu khí.
51
PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ THỐNG KÊ
B.1 Kết quả thống kê của thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của tỷ lệ giấm, đườngtrong phối trộn gia vị nước sốt. trong phối trộn gia vị nước sốt.
General Linear Model: DTBCTL versus T1, T2 Factor Type Levels Values
T1 fixed 3 Đường 7%, Đường 8%, Đường 9% T2 fixed 3 Giấm 18%, Giấm 19%, Giấm 20% Analysis of Variance for DTBCTL, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P T1 2 15.9180 15.9180 7.9590 21.94 0.000 T2 2 4.3495 4.3495 2.1747 5.99 0.010 T1*T2 4 3.4673 3.4673 0.8668 2.39 0.089 Error 18 6.5301 6.5301 0.3628 Total 26 30.2649 S = 0.602317 R-Sq = 78.42% R-Sq(adj) = 68.83% Least Squares Means for DTBCTL
T1 Mean SE Mean Đường 7% 14.88 0.2008 Đường 8% 16.69 0.2008 Đường 9% 15.32 0.2008 T2 Giấm 18% 15.17 0.2008 Giấm 19% 16.15 0.2008 Giấm 20% 15.57 0.2008 T1*T2 Đường 7% Giấm 18% 14.20 0.3477 Đường 7% Giấm 19% 14.99 0.3477 Đường 7% Giấm 20% 15.47 0.3477 Đường 8% Giấm 18% 16.30 0.3477
52 Đường 8% Giấm 19% 17.65 0.3477 Đường 8% Giấm 20% 16.11 0.3477 Đường 9% Giấm 18% 15.02 0.3477 Đường 9% Giấm 19% 15.81 0.3477 Đường 9% Giấm 20% 15.14 0.3477
Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence T1 N Mean Grouping
Đường 8% 9 16.69 A Đường 9% 9 15.32 B Đường 7% 9 14.88 B
Means that do not share a letter are significantly different.
Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence T2 N Mean Grouping
Giấm 19% 9 16.15 A Giấm 20% 9 15.57 A B Giấm 18% 9 15.17 B
Means that do not share a letter are significantly different.
Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence T1 T2 N Mean Grouping Đường 8% Giấm 19% 3 17.65 A Đường 8% Giấm 18% 3 16.30 A B Đường 8% Giấm 20% 3 16.11 A B Đường 9% Giấm 19% 3 15.81 B C Đường 7% Giấm 20% 3 15.47 B C Đường 9% Giấm 20% 3 15.14 B C Đường 9% Giấm 18% 3 15.02 B C Đường 7% Giấm 19% 3 14.99 B C Đường 7% Giấm 18% 3 14.20 C
53
General Linear Model: DTBCTL versus T1, T2 Factor Type Levels Values
T1 fixed 3 Đường 7%, Đường 8%, Đường 9% T2 fixed 3 Giấm 18%, Giấm 19%, Giấm 20% Analysis of Variance for DTBCTL, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P T1 2 15.9180 15.9180 7.9590 17.51 0.000 T2 2 4.3495 4.3495 2.1747 4.79 0.019 Error 22 9.9975 9.9975 0.4544
Total 26 30.2649
S = 0.674115 R-Sq = 66.97% R-Sq(adj) = 60.96% Least Squares Means for DTBCTL
T1 Mean SE Mean Đường 7% 14.88 0.2247 Đường 8% 16.69 0.2247 Đường 9% 15.32 0.2247 T2 Giấm 18% 15.17 0.2247 Giấm 19% 16.15 0.2247 Giấm 20% 15.57 0.2247
Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence T1 N Mean Grouping
Đường 8% 9 16.69 A Đường 9% 9 15.32 B Đường 7% 9 14.88 B
Means that do not share a letter are significantly different.
Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence T2 N Mean Grouping
54 Giấm 20% 9 15.57 A B Giấm 18% 9 15.17 B
Means that do not share a letter are significantly different. General Linear Model: Mau sac versus T1, T2
Factor Type Levels Values
T1 fixed 3 Đường 7%, Đường 8%, Đường 9% T2 fixed 3 Giấm 18%, Giấm 19%, Giấm 20% Analysis of Variance for Mau sac, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P T1 2 0.38222 0.38222 0.19111 5.16 0.017 T2 2 0.24000 0.24000 0.12000 3.24 0.063 T1*T2 4 0.17778 0.17778 0.04444 1.20 0.345 Error 18 0.66667 0.66667 0.03704 Total 26 1.46667 S = 0.192450 R-Sq = 54.55% R-Sq(adj) = 34.34% Least Squares Means for Mau sac
T1 Mean SE Mean Đường 7% 3.911 0.06415 Đường 8% 4.200 0.06415 Đường 9% 4.022 0.06415 T2 Giấm 18% 3.978 0.06415 Giấm 19% 4.178 0.06415 Giấm 20% 3.978 0.06415 T1*T2 Đường 7% Giấm 18% 3.800 0.11111 Đường 7% Giấm 19% 3.933 0.11111 Đường 7% Giấm 20% 4.000 0.11111
55 Đường 8% Giấm 18% 4.133 0.11111 Đường 8% Giấm 19% 4.400 0.11111 Đường 8% Giấm 20% .067 0.11111 Đường 9% Giấm 18% 4.000 0.11111 Đường 9% Giấm 19% 4.200 0.11111 Đường 9% Giấm 20% 3.867 0.11111
Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence T1 N Mean Grouping
Đường 8% 9 4.200 A Đường 9% 9 4.022 A B Đường 7% 9 3.911 B
Means that do not share a letter are significantly different.
Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence T2 N Mean Grouping
Giấm 19% 9 4.178 A Giấm 20% 9 3.978 A Giấm 18% 9 3.978 A
Means that do not share a letter are significantly different.