Tách chiết ADN là công việc đầu tiên đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu sinh học phân tử . Để tách chiết ADN thành công cần phải lựa chọn phương pháp phù hợp với từng đối tượng.
Trong nghiên cứu này ADN của ngao được tách chiết theo phương pháp Crandall (1999). Như ta đã biết trong thành phần đệm chiết dùng để tách ADN thì CTAB đóng vai trò quan trọng vì nó là một chất tẩy có tác dụng phá vỡ màng tế bào để giải phóng ADN và dịch chất. Hơn nữa CTAB còn có khả năng tách ADN ra khỏi màng nhân do chúng có khả năng hòa tan dịch nhân trong đệm chiết. Nếu tăng đệm chiết CTAB thì ADN có thể kết hợp với CTAB tạo thành phức hợp ADN- CTAB. Phức hợp này sẽ tan vào dung dịch có nồng độ muối lớn hơn 0,7M. Nhưng nó sẽ bị tủa trong đệm chiết có nồng độ muối
0,4M. Dựa vào đó có thể tách ADN ra khỏi polysacarit, protein và các thành phần khác của dung dịch. Bằng phương pháp trên chúng tôi đã tách được ADN của mẫu ngao Bến Tre thu ở 6 quần thể Nam Định, Thái Bình, Thanh Hóa, Tp Hồ Chí Minh, Bến Tre và Cà Mau.
Kết quả tách chiết ADN tổng số của các mẫu ngao Bến Tre được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel Agarose 1% . Kết quả điện di cho thấy các băng ADN thu được của các mẫu ngao Bến Tre khá gọn và đồng đều chứng tỏ chất lượng ADN của các mẫu khá tốt (Hình .1)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 40
Hình 3.1. Kết quả kiểm tra ADN tổng số quần thể ngao Bến Tre tại Thanh Hóa trên gel agarose 1% 3.2. Kết quả nhân ADN đặc hiệu
Khi chạy PCR với cặp mồi đặc hiệu, đoạn Microsatellite của các mẫu ngao Bến Tre được nhân lên. Việc kiểm tra sản phẩm PCR được tiến hành bằng chạy điện di trên gel Agarose1%. Kết quảđược trình bày ở hình 3.2:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 41
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm Microsatellte quần ngao Nam Định với loci MME15 - CQ141846 kiểm tra trên gel Agarose1%
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 42 Sản phẩm Microsatellite được kiểm trên gel polyacrylamide 4,5% điện di nhuộm bạc. Kết quảđược trình bày ở hình 3.3:
Hình 3.3. Kết quả sản phẩm Microsatellite với loci MME15-GQ141846 của quần thể ngao Nam Định được điện di trên gel polyacrylamide 4,5%. 3.3. Mức độ đa dạng di truyền của một số quần thể ngao Việt Nam
Tính đa dạng di truyền được đánh giá qua các chỉ số như: sựđa hình các alen của từng locus, trung bình số lượng alen trên một locus, tần số di hợp tử và lượng thông tin đa hình (Polymophic Information Content –PIC). Kết quảđược trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3.1. Số lượng alen, tần số dị hợp tử theo lý thuyết (He), tần số dị hợp tử quan sát (Ho), giá trị thông tin đa hình (PIC), hệ số cận huyết và kết quả kiểm định từng
locus Microsatellite với giả thiết không cân bằng di truyền Hardy-Weinberg
Locus Số lượng alen He Ho PIC HW –test
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 43 GQ141833 MME12 GQ141843 10 0,913 0,871 0,827 * MME13 GQ141844 7 0,872 0,753 0,592 * MME15 GQ141846 12 0,921 0,871 0,82 * Trung bình 9,25 0,900 0,854 0,762
* Không cân bằng di truyền Hardy-Weinberg với ý nghĩa <0,01
Bốn locus Microsatellite đều thể hiện tính đa hình cao. Số lượng alen được phát hiện trên bốn locus từ 7-12 alen (Trung bình 9,25 alen/locus). Trong đó đa hình cao nhất thể hiện ở locus MME15-GQ141846 với 12 alen, ngược lại thấp nhất ở locus MME13-GQ141844 với 7 alen.
Tần số dị hợp tử mong đợi với mỗi locus phân bố trong khoảng giá trị thấp là 0,872 ở loci MME13-GQ141844 tới giá trị cao nhất 0,921 ở loci MME15- GQ141846. Trung bình tần số dị hợp tử mong đợi (He) và quan sát (Ho) trên toàn bộ 4 locus tương ứng là 0,9 và 0,854. Giá trị thông tin đa hình của mỗi locus dao động từ 0,592 đến 0,827.
Kết quả nghiên cứu về đa dạng di truyền ngao (Meretrix lyarata) chưa được công bố, tuy nhiên so sánh đa dạng di truyền của ngao Việt Nam với ngao dầu Trung Quốc (Meretrix meretrix) cho thấy ngao Việt Nam có đa dạng di truyền cao hơn ngao Trung Quốc. Theo công bố của Wang và ctv (2009) số lượng alen của các quần thể ngao dầu từ 1 - 17 alen. Tần số dị hợp tử theo lý thuyết từ 0,154 - 0,932, tần số di hợp tử quan sát dao động từ 0,166 - 0,933.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 44 Kết quả kiểm định sự cân bằng di truyền của từng loci Microsatellite cho thấy hầu hết các locus đều không ở trạng thái cân bằng (P<0,01). Theo Nei (1978), lạc dòng di truyền, giao phối cận huyết, chọn lọc các tính trạng liên kết, cách ly địa lý có thể là các nguyên nhân dẫn đến không cân bằng di truyền của một quần thể. Thực tế cho thấy trong sản xuất giống ngao hiện nay chủ yếu dựa và nguồn ngao bố mẹ thu gom ngoài tự nhiên. Đặc biệt ở miền Bắc chủ yếu thu gom ngao bố mẹ ở Nam Định có thể dẫn đến hiện tượng cận huyết xẩy ra.
Đa dạng di truyền một số quần thể ngao ở Việt Nam được trình bày chi tiết ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Tần số dị hợp tử quan sát (Ho), dị hợp tử mong đợi theo lý thuyết (He) trung bình alen trên locut (K), Hệ số đồng huyết (Fis), kiểm định với giả thuyết
không tuân theo định luật di truyền Hardy –Weinberg ở các quần thể ngao
Quần thể He Ho K Fis HWE-est Nam Định 0,54 0,60 5,21 0,152 * Thái Bình 0,59 0,52 4,35 0,121 * Thanh Hóa 0,63 0,53 4,20 0,080 * Bến Tre 0,85 0,84 7,86 0,018 NS HCM 0,83 0,73 6,86 0,023 * Cà Mau 0,81 0,82 7,64 0,016 NS NS: Không có ý nghĩa, * Với ý nghĩa P<0,05
Qua bảng 3.2 ta thấy tần số dị hợp tử mong đợi cao nhất ở quẩn thể ngao Bến Tre (0,85) và thấp nhất ở quần thể ngao Nam Định (0,54). Tần số di hợp tử quan sát cao nhất ở quần thể ngao Bến Tre (0,84) và thấp nhất ở quần thể ngao Thái Bình (0,52). Trung bình số alen được phát hiện trên quần thể cao nhất ở quần đàn
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 45 ngao Bến Tre với 7,86 alen/quần thể và thấp nhất ở quần thể ngao Thanh Hóa với 4,20 alen/quần thể.
3.4. Mức độ cận huyết của các quần thể ngao
Kết quả kiểm tra sự cần bằng di truyền theo Hardy Weinberg cho thấy đa số các quần thể không ở trạng thái cân bằng di truyền ngoại trừ các quần thể ngao ở miền Nam là Bến Tre và Cà Mau. Do đó xét về phương diện tổng thể thì ngao Việt Nam đang có nguy cơ không cân bằng di truyền cao.
Từ kết quảở bảng 3.2 chúng ta thấy hệ sốđồng huyết của các quần thể ngao dao động từ 0,016 (Quần thể ngao Cà Mau) – 0,152 (Quần thể ngao Nam Định). Các quần thể ngao ở miền Nam có hệ sốđồng huyết thấp hơn các quần thể ngao ở miền Bắc. Đây có thể là hệ quả của việc chung chuyển ngao từ miền Nam ra miền Bắc, quá trình sử dụng số lượng ngao bố mẹ ít và ở một địa điểm để cho sinh sản dẫn đến mức độđồng huyết cao ở các quần thể ngao miền Bắc.
3.5. Mối quan hệ và khoảng cách di truyền giữa các quần thể (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khoảng cách di truyền của các quần thể ngao được ước lượng theo giá trị Fst và được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ma trận giá trị sai khác di truyền (Fst) giữa các quần thể phân bố ở 6 quần thể ngao
TB TH BT TPHCM CM NĐ 0,002 0,001 0,063 0,098 0,071 TB 0,003 0,068 0,083 0,083 TH 0,071 0,076 0,072 BT 0,037 0,081 TPHCM 0,031
Kết quả cho thấy sự sai khác giữa các quần thể ngao ở mức trung bình (Fst = 0,053). Các quần thể ngao ở miền Bắc (Nam Định, Thái Bình, Thanh Hóa) không
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 46 có sự sai khác lớn với trung bình Fst = 0,004. Các quần thể ngao ở miền Nam (Bến Tre, Tp HCM, và Cà Mau) có sự sai khác rõ rệt với trung bình Fst = 0,086. Theo Nei (1978) nếu Fst<0,05 được cho là sai khác nhỏ, 0,5<Fst<0,15 là trung bình và Fst >0,15 là cao.
Cây phân loài di truyền của các quần thể ngao ở Việt Nam được xây dựng dựa trên khoảng cách di truyền chuẩn của Nei (1972) và được trình bày ở hình 3.3.
Hình 3.4 . Cây phân loài di truyền của một số quần thể ngao ở Việt Nam.
Kết quả phân tích mối quan hệ giữa các quần thể ngao cho thấy quần thể ngao Nam Định, Thái Bình và Thanh Hóa rất gần gũi nhau và gần với quần thể ngao Bến Tre. Quần thể ngao Tp Hồ Chí Minh (Cần Giờ) gần với quần thể ngao Cà Mau và xa với các
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 47 quần thể ngao ở miền Bắc. Điều này hoàn toàn phù hợp với kết quả phỏng vấn nguồn gốc các giống ngao ở các tỉnh phía Bắc. Ngao giống ở các tỉnh phía bắc chủ yếu được du nhập ở các tỉnh phía Nam từ những năm 90 của thế kỷ trước nhưng 5 năm gần đây phong trào nuôi ngao mới phát triển mạnh. Sản lượng ngao giống tại chỗ chỉđáp ứng khoảng 10% còn lại 90% vẫn nhập giống từ các tỉnh phía Nam đặc biệt là tỉnh Bến Tre và những năm gần đây thì khai thác giống ở Cà Mau.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 48
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 1. Kết luận
Kết quả nghiên cứu bước đầu về đa dạng di truyền một số quần thể ngao ở Việt Nam cho thấy:
- Bốn locus Microsatellite đều cho tính đa hình cao với số allen/locus từ 7 - 12 allen. Tần số dị hợp tử mong đợi dao động từ 0,872 – 0,921.
- Quần thể ngao Bến Tre có tần số dị hợp tử mong đợi cao nhất (0,85) và thấp nhất ở quần thể ngao Nam Định (0,54). Tần số dị hợp tử quan sát cao nhất ở quần thể ngao Bến Tre (0,84) và thấp nhất ở quần thể ngao Thái Bình.
- Hệ sốđồng huyết của các quần thể ngao dao động từ 0,016 (Quần thể ngao Cà Mau) – 0,152 (Quần thể ngao Nam Định). Các quần thể ngao ở miền Nam có hệ sốđồng huyết thấp hơn các quần thể ngao ở miền Bắc.
- Sự sai khác giữa các quần thể ngao ở mức trung bình (Fst = 0,053). Các quần thể ngao ở miền Bắc (Nam Định, Thái Bình, Thanh Hóa) không có sự sai khác lớn với trung bình Fst = 0,004. Các quần thể ngao ở miền Nam (Bến Tre, Tp HCM, và Cà Mau) có sự sai khác rõ rệt với trung bình Fst = 0,086. Theo Nei (1978) nếu Fst<0,05 được cho là sai khác nhỏ, 0,5<Fst<0,15 là trung bình và Fst >0,15 là cao.
- Có hiện tượng đồng huyết xảy ra ở các quần thể ngao ngoại trừ quần thể ngao thu tại Bến Tre và Ca Mau.
- Các quần thể ngao ở miền Bắc có quan hệ gần gũi với quần thể ngao ở tỉnh Bến Tre.
2. Đề xuất
Các nghiên cứu tiếp theo cần tăng số lượng cặp mồi Microsatellite và sử dụng thêm chỉ thị SNP đểđánh giá ĐDDT các quần thể ngao Bến Tre tại Việt Nam.
Đánh giá ĐDDT được nghiên cứu trên 6 quần thể là chưa đủ lớn vì vậy cần có thời gian phân tích đánh giá trên nhiều quần thể như: Quảng Ninh, Nghệ An, Tiền Giang, Sóc Trăng, Bạc Liêu... để có được số liệu toàn diện về đa dạng di truyền ngao Bến Tre tại Việt Nam.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 49 Quần thể ngao ở tỉnh Bến Tre có tính ĐDDT cao nên cần có các biện pháp bảo tồn.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu trong nước:
1. Bộ Thủy sản và Ngân hàng Thế giới tháng 6 (2006), Hướng dẫn quản lý môi trường trong đầu tư nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam.
2. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang (1999), Di truyền phân tử - những nguyên tắc căn bản trong chọn giống cây trồng, NXB Nông Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh.
3. Nguyễn Chính (1996), Một số loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ (Bivalve Mollusc) có giá trị kinh tế ở biển Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, 132 tr.
4. Trần Thúy Hà và ctv (2012), Tìm hiểu đặc điểm di truyền một số quần đàn tôm thẻ chân trắng nuôi tại Việt Nam bằng chỉ thị Microsatellite, Tạp trí khoa học và phát triển 2013, Tập 11, Số 6, trang 797 - 803.
5. Nguyễn Đinh Hùng (2000), Nghiên cứu các điều kiện sinh thái môi trường ảnh hưởng đến quá trình nuôi nghêu Bến Tre Meretrix lyrata (Sowerby, 1851) ở vùng ven biển Tiền Giang, Bến Tre, Luận án cao học.
6. Trương Quốc Phú (1996), Nuôi ngao thương phẩm ở đồng bằng Sông MêKông, Việt Nam, The ICLARM Quarterly October, 1996. Vol. 19. No. 4, p 60 – 62 PGS. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
7. Trương Quốc Phú (1996), Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, sinh hóa và kỹ thuật nuôi nghêu Meretrix Lyrata (Sowerby, 1851) đạt năng suất cao, Luận án phó tiến sĩ khoa học, Đại học thủy sản, Nha Trang.
8. Trương Quốc Phú (1999), Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, sinh hóa và kỹ thuật nuôi nghêu Meretrix lyrata (Sowerby, 1851) đạt năng suất cao, Luận án tiến sĩ khoa học, Đại học thủy sản, Nha Trang.
9. Nguyễn Hữu Phụng (1996), Đặc điểm sinh học và kỹ thuật ương nuôi ấu trung ngao Bến Tre Meretrix lyrata (Sowerby, 1851), Tạp chí Khoa học và công nghệ số 7 và 8, tr 13-21 và 14 – 18.
10. Nguyễn Hữu Phụng, Võ Sĩ Tuấn và Nguyễn Huy Yết (2001), Phân bố và nguồn lợi động vật thân mềm kinh tế thuộc lớp chân bụng (Gastropoda) và lớp hai mảnh vỏ (Bivalvia) ở ven biển Việt Nam, Tuyển tập báo cáo khoa
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 51 học Hội thảo động vật thân mềm toàn quốc lần thứ nhất, NXB Nông Nghiệp, TP Hồ Chí Minh, tr 27-60.
11. Phạm Hồng Sơn (2006), Giáo trình Kỹ thuật cơ bản trong sinh học phân tử, NXB Đại học Huế, tr 108 – 110.
12. Lê Xuân Sinh, Đỗ Minh Trung, Huỳnh Văn Hiền và Trương Quốc Phú (2007), Nghiên cứu thị trường nghêu (Meretrix lyrata)ở Trà Vinh trong mối quan hệ với các tỉnh phía Nam Việt Nam, Tạp chí khoa học 2007: 8 38-46, Trường Đại Học Cần Thơ.
13. Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Nam Định tháng 6 (2011), Báo cáo “Thực trạng phát triển nuôi trồng thủy sản năm 2010, định hướng phát triển năm 2011”.
14. Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Thái Bình tháng 6 (2011), Báo cáo “Tình hình nuôi và dịch bệnh Ngao trong tỉnh từ năm 2009 đến năm 2011”.
15. Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Thái Bình tháng 8 (2014), Báo cáo “Tình hình nuôi ngao bị thiệt hại của tỉnh trong 6 tháng đầu năm 2014”. 16. Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Thanh Hóa tháng 6 (2011), Báo
cáo tình hình nuôi Ngao tại Thanh Hóa.
17. Nguyễn Thành Tâm và Phạm Thành Liêm (2012), Sử dụng phương pháp Microsatellite và RAPD để kiểm tra sự khác biệt di truyền của 2 quần đàn Tôm càng T Việt Nam và Trung Quốc, Tạp trí khoa học, Đại học Huế, Tập 75A, Số 6 (2012) trang 135 - 142.
18. Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen nguyên lý và ứng dụng, NXB Khoa học và Kỹ thuật.
19. Nguyễn Thị Thảo, Quyền Đình Thi, Đào Thị tuyết, Lê Thị Thu Giang và Phạm Anh Tuấn (2004), Đánh giá đa hình 3 quần đàn tôm sú (Peneaus monodo) nuôi ở Việt Nam bằng phương pháp Microsatellite, Tạp chí Công nghệ sinh học 2(3): 315 – 324
20. Chu Chí Thiết và Martin S Kumar (2008), Tài liệu về kỹ thuật sản xuất giống Ngao Bến Tre Meretrix lyrata (Sowerby, 1851).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 52 Phạm Anh Tuấn (2003), Sử dụng Microsatellite, mtRFLP và RAPD để