Ở Trung Quốc nhiều nghiên cứu phân loại cũng như đa dạng di truyền của ngao đã được thực hiện. Các nghiên cứu này đã làm sáng tỏ mối liên hệ giữa các loài ngao và sựđa dạng của ngao ở từng vùng khác nhau. He và ctv (2010) đã giải mã thành công toàn bộ gen ty thể của ngao M. Meretrix. Tổng genenome là 19,826bp. Mối quan hệ phả hệ của các loài ngao M. Meretrix, M. lamarckii, M. lusoria, M. lyrata, M. petechialis đã được làm sáng tỏ bởi Chen và ctv (2009). Các tác giả đã giải mã trình tự ADN vùng gen COI ở ty thể các loài ngao và cho rằng M. meretrix, M. lusoria và M. petechialis chỉ là một loài do cùng chung một số haplotype. 10 microsatellite của ngao dầu được Wang và ctv phân lập thành công Wang và ctv (2009).
Hong và ctv (2011) đã đánh giá di truyền tính trạng sinh trưởng của ngao dầu thông qua chọn lọc 12 gia đình mỗi gia đình được chọn từ 25-30 cá thể. Hệ số di truyền được tính thông qua các chỉ số như tổng khối lượng, chiều dài vỏ, chiều cao và độ rộng của vỏ. Kết quả cho thấy các tính trạng di truyền tỷ lệ thuận với sinh trưởng của ngao. Hệ số di truyền có thể đạt từ 0,64-0,85. Do vậy tính trạng sinh trưởng của ngao có thểứng dụng trong chương trình chọn lọc giống.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21 Nhìn chung các nghiên cứu về ngao ở trong nước đa số tập trung vào sinh học sinh sản, kỹ thuật sản xuất giống và nuôi thương phẩm một số đối tượng kinh tế. Trong đó có một vài nghiên cứu công trình nghiên cứu như của Nguyễn Tác An và Nguyễn Văn Lục (1994) ở Trà Vinh về điều tra và đánh giá nguồn lợi hoặc một vài tác giả khác như của Nguyễn Hữu Phụng (1996) và Võ Sĩ Tuấn và ctv (1998). Trương Quốc Phú (2001), nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, sinh hóa và kỹ thuật nuôi ngao (Meretrix lyrata) , thực hiện tại các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long chủ yếu tại bãi Tân Thành huyện Gò Công tỉnh Tiền Giang.
Nghiên cứu sản xuất giống ngao của Viện nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản II do Nguyễn Đình Hùng và ctv (2000) thực hiện, kết quả cho thấy hiện tượng lưỡng tính ở ngao (Meretrix lyrata), ngao sinh sản hàng năm, mùa sinh sản chính từ tháng 5 đến tháng 7, mùa phụ từ tháng 11 đến giêng năm sau, với tỷ lệ đực cái trong tự nhiên là 1/1. Chu Chí Thiết và ctv (2005), nghiên cứu kỹ thuật sản xuất giống ngao tại các tỉnh miền Trung.
Mặc dù ngao Bến tre là đối tượng nuôi quan trọng ở Việt Nam, nhưng chưa có nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền các quần thể ngao ở Việt Nam.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu.
2.1.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu.
Ngao Bến Tre sử dụng trong nghiên cứu được thu ngoài tự nhiên tại Thái Bình, Nam Định, Thanh Hóa, Bến Tre, Tp Hồ Chí Minh và Cà Mau.
Thời gian thu từ tháng 7 - 11/2013.
Mẫu thu về được phân tích tại Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Thủy sản - Trường Cao đẳng thủy sản Bắc Ninh
Thời gian nghiên cứu từ tháng 4/2013 - 4/2014 Bản đồ thu mẫu:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24 Kí hiệu mẫu: Bảng 2.1
Bảng 2.1. Địa điểm thu mẫu và số lượng mẫu phân tích. STT Quần thể Kí hiệu Địa điểm thu mẫu
Số mẫu thu Số mẫu phân tích microsatellite
1 Thái Bình TB Đông Minh-Tiền Hải-
Thái Bình
50 50
2 Nam Định NĐ Xuân Phong-Giao Xuân-
Giao Thủy-Nam Định 50 50 3 Thanh Hóa TH Xóm 6 - Hải Hậu - Hải Lộc - Thanh Hóa 50 50 4 TP HCM TP Cần giờ - TP Hồ Chí Minh 50 50
5 Bến Tre BT Xã Bảo Thuận - Huyện
Ba Tri - Bến Tre
50 50
6 Cà Mau CM Xã Đất Mũi - Huyện
Ngọc Hiển - Cà Mau
50 50
2.1.2. Phương pháp thu và bảo quản mẫu
Phương pháp thu mẫu: Dùng cào chuyên biệt để thu, ở mỗi vùng ngao phân bố ngoài tự nhiên chọn năm xã tại mỗi quần thể, mỗi xã thu 10 mẫu và mỗi mẫu lấy khoảng 5g phần cơ màng áo của ngao Bến Tre(mẫu phải tươi), bảo quản mẫu trong Ethanol 80%. Cỡ ngao thu mẫu dao động từ 15-20g/con. Ngao tự nhiên có đường vân ởđỉnh sinh trưởng dầy hơn so với ngao nuôi.
2.1.3. Thiết bị
Máy PCR, bộ điện di đứng, bộ điện di nằm, tủ lạnh, tủ âm, micropipette, đầu côn các loại, ống eppendorf 1,5ml và 0,2ml; , cối chày, đèn cồn, pank, dao, kéo để cắt mẫu…
Micropipette các loại: 2µl, 20µl, 200µl, 1000µl
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25
Hình 2.2. Máy PCR MyGenic 96 Thermal Block
2.1.4. Hóa chất
- Một số hóa chất thông dụng dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử bao gồm CTAB, Tris base, NaCl, EDTA, Ammonium acetate 7.5M
ProteinaseK 20mg/ml, Isopropanol 99%, Ethanol (100% và 70%),Nước cất khử trùng.
Cell Lysis Solution: 10 mM Tris, 100mM EDTA, 2% SDS pH 8; Ammonium acetate 7,5 M; Ammonium acetate: 115,62g; Dung dịch nước khử Iôn; Ethdiumbromide.
- Các hóa chất dùng cho phản ứng PCR: 4 loại deoxynucleotit triophosphat (dNTPs) của hãng BioRad , Taq – ADN Polymerase của BioRad.
- Để nhân đoạn microsatellite của ngao, 4 cặp mồi được lựa chọn trong nghiên cứu của Wang và ctv (2009) gồm: MME02 - GQ141833, MME12 -
GQ141843, MME13 - GQ141844, MME15 - GQ141846 để khuyếch đại
Microsatellite của ngao.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26 Tre được thực hiện theo sơđồ sau:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27
2.2.1. Tách ADN tổng số
ADN của ngao được tách chiết theo phương pháp Crandall (1999).
Hóa chất tách chiết:
Cell Lysis Solution: 10mM Tris HCl, 100mM EDTA, 2% SDS: pH = 8 Ammonium acetate 7,5M
ProteinaseK 20mg/ml Isopropanol 99% Ethanol (90% và 70%) Dung dịch nước khử Iôn
Tách ADN tổng số Kiểm tra chất lượng ADN Nhân ADN đặc hiệu Phân tích đa hình alen các locus Phân tích thống kê Xác định cấu trúc quần thể
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28
SDS: Là một chất tẩy rửa tổng hợp, có tác dụng phá vỡ cấu trúc màng tế bào và làm biến tính các enzim nội bào. Ngoài ra nó còn có vai trò kích thích hoạt động của enzim proteinase K.
Các bước tiến hành:
Gồm có 3 bước chính:
Phá vỡ màng tế bào và nhân
Loại bỏ các tạp chất và hòa tan ADN Kết tủa AND
Qui trình cụ thể:
Bổ sung 700 µl Isopropanol
- Cho vào ống Eppendorf
Thêm 240 µl Ammonium acetate Thêm 700µl dung dịch Ethanol 700 Hòa tan tủa bằng 50µl TE hoặc nước cất bảo quản 40C - Để tủ lạnh sâu ít nhất 1h. - Ly tâm 13000v/5 phút. - Bỏ tủa thu dịch sang ống - Votex khoảng 10-20 lần. - Ly tâm 13000v/5 phút. - Để tủ lạnh ít nhất 1h - Ly tâm 13000v/10 phút - Hút 5µl ProteinK, nghiền kĩ - Votex khoảng 10-20 lần. - Ủ 550C trong 10 phút - Votex khoảng 10-20 lần. - Ly tâm 13000/5 phút. - Bỏ dịch, giữ lại phần kết tủa Bổ sung 500µl Cell lysis
solution Cắt khoảng 50mg
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30
♦ Bước1: Lấy mẫu xét nghiệm (cắt khoảng 50-100mg thịt ngao) cho vào ống eppendorf 1,5ml.
♦ Bước 2: Thêm 720µl dung dich cell lysis solution vào ống đã chứa mẫu. ♦ Bước 3: Sau đó nghiền kĩ bằng chày.
♦ Bước 4: Bổ sung thêm 5µl dung dịch Protein K vào ống. ♦ Bước 5: Lắc đều mẫu trên máy lắc khoảng 10-20 lần. ♦ Bước 6: Đem ủ mẫu ở 550 C trong 10 phút.
♦ Bước 7: Thêm 240µl dung dịch Ammonium acetate vào ống.
♦ Bước 8: Lắc đều trên máy Votex sau đó đem để ở lạnh sâu -200C trong ít nhất 1 giờ.
♦ Bước 9: Lấy mẫu trong tủ lạnh ra đem ly tâm với tốc độ 13000 rpm/phút trong 5 phút. Bỏ tủa, thu dịch.
♦ Bước 10: Bổ sung 700µl dung dịch Isoprotanol.
♦ Bước 11: Votex mẫu khoảng 20 (s) . Sau đó ly tâm 13000 rpm/phút trong 5 phút.
♦ Bước 12: Để mẫu trong tủ lạnh ít nhất trong 1h sau đó lấy ra ly tâm 13000 rpm /phút trong 10 phút. Bỏ dịch, thu tủa.
♦ Bước 13: Thêm 700µl dung dịch Ethanol 700. ♦ Bước 14: Ly tâm 13000 rpm /phút trong 5 phút.
♦ Bước 15: Bỏ dịch thu tủa, để khô ở nhiệt độ phòng qua đêm. ♦ Bước 16: Bổ sung 50 - 100 µl dung dịch TE, bảo quản lạnh. ◙ Kiểm tra chất lượng ADN
1.Chuẩn bị 25ml gel Agarose với nồng độ 1%: * Cân 0,25 g Agarose cho vào ống.
* Cho 25 ml dung dịch TAE 1X vào ống.
* Đun trên lò vi sóng cho tan hoàn toàn, để nguội khoảng 550C
* Sau đó đổ dung dịch vào khuôn gel có cài lược sẵn để tạo các giếng, chờ cho đông lại.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 31 2.Cho mẫu vào giếng:
* Mẫu gồm 3 µl ADN và 1 µl Loading dye * Dùng pipet hút mẫu nạp vào các giếng.
3.Chỉnh hiệu điện thế 110 V. Phương pháp tiến hành trong khoảng 45 phút. Khi vạch chạy 2/3 bản gel thì dừng lại. Mang bản gel sau khi chạy điện di đi nhuộm bằng Ethidium bromide trong 10 phút, rửa bản gel bằng nước sạch rồi mang quan sát dưới đèn UV. Kết quả điện di cho các vạch gọn, phân tách rõ ràng nghĩa là ADN trong mẫu đã tinh sạch cho nghiên cứu tiếp.
2.2.2. Nhân ADN đặc hiệu
Mỗi phản ứng PCR gồm các thành phần được trình bày trong bảng sau:
Bảng 2.2: Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR
TT Thành phần Thể tích(µl)
1 Nước tinh khiết 4,2
2 Buffer 5X 2,5
3 MgCl2 25Mm 1,5
4 dNTPs 10Mm 2,5
5 Taq AND polymerase 5U/µl 0,3
6 Primer forward 1,0
7 Primer reverse 1,0
8 AND khuôn 1,0
Tổng thể tích của một phản ứng 14,0
Để nhân đoạn Microsatellite của ngao, 4 cặp mồi được lựa chọn trong nghiên cứu của Wang và ctv (2009) gồm: MME02, GQ141833; MME12,
GQ141843; MME13, GQ141844; MME15, GQ141846 để khuyếch đại
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32
Bảng 2.3: Cặp mồi dùng để khuếch đại Microsatellite của ngao
Microsatellite s Primer sequence (5’ – 3’) Nhiệt độ gắn mồi(OC ) Nồng độ Mg++(mM ) Kích thướ c (bp) MME02 GQ141833 GACTGGAGGAGGAGACGAAG GCAAAGTGCAGGTAGAAGAG G 50 1,5 190 MME12 GQ141843 CCGCTAGAAAGTAAAGTGTC CA CACATCTATCCGATCAATTTT TG 54 1,5 156 MME13 GQ141844 TGAATTTATTCTTGCCATCGT G AAAAGGAGCAGCAACAGAGC 55 2 153 MME15 GQ141846 TCCACACTGTTGGCAATATGA CCATATTCCAGTGTCCACAGC 55 1,5 167
Phản ứng PCR khuyếch đại các vùng Microsatellite của ngao được thực hiện trên máy PCR MyGenic 96 Thermal Block với điều kiện phản ứng:
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Các bước Nhiệt độ Thời gian
1 94 3phút 2 94 30 giây 3 55 (Nhiệt độ gắn mồi ở bảng 2.3) 30 giây 4 72 30 giây 5 Lặp lại từ bước 2 đến bước 4 25 lần 6 72 3 phút
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33
Tổng thời gian 1h59 phút
Các sản phẩm PCR được bảo quản trong tủ lạnh cho đến khi được tra vào bản gel.
2.2.3. Phân tích đa hình alen các locus Microsatellite
Sản phẩm Microsatellite được kiểm tra trên gel polyacrylamide 4,5%, chạy với dung dịch đệm TBE 1X.
► Xử lý kính
♦ Bước 1: Rửa sạch cả 2 tấm kính bằng dung dịch xà phòng sau đó tráng sạch với nước.
♦ Bước 2: Lau khô sau đó làm sạch cả 2 tấm kính bằng cồn tuyệt đối, để khô trong 5 phút.
♦ Bước 3: Xử lý tấm kính nhỏ: lau kính nhỏ với dung dịch binding solution (EtOH 95% 1ml, Acetic acid 5µl, γmethacryloxy propyl trimoethoxylane 3µl) và để khô. ♦ Bước 4: Gắn 2 tấm kính sao cho 2 mặt kính sạch đối diện nhau tạo thành sandwiches plates.
►Chuẩn bị gel 60ml polyacrylamide 4.5%
Lấy 60 ml 4,5% acrylamide (bao gồm 6,74 ml acrylamide gel (19:1), 25,2g Urea, 6ml TBE10x, và thêm nước đến 60ml) cho vào 1 cốc 100ml.
Chuẩn bị 0,25% ammonium persulphate: cân 0,025mg của ammonium persulphate cho vào ống Eppendord, và thêm 100µl H2O.
Thêm 60µl TEMED và 60µ 0,25% ammonium persulphate vào dung dịch gel và khuấy đều.
Đặt 2 tấm kính đã xử lý ở trên nghiêng 1 góc 45o, dùng xi lanh hút hết dung dịch gel và nhỏ từ từ vào khe giữa 2 tấm kính sao cho không tạo bọt khí bên trong gel. Gắn lược tạo giếng.
Để gel đông kết khoảng 1 giờ.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34 Khi gel đã khô, tháo lược và gắn bản gel vào trong máy điện di.
Đổ TBE1x vào bể trên tới vạch qui định
Đổ TBE1x vào bể dưới sao tới khi chạm tới gel
Đóng nắp bể trên và bể dưới. Chạy tiền khởi ởđiện thế 100W, 20V trong 30 phút để làm nóng bản gel.
► Điện di
Khoảng 10 phút trước khi kết thúc quá trình chạy tiền khởi ở trên, chúng ta sẽ chuẩn bị mẫu để tra vào giếng chạy điện di.
Ly tâm mẫu và đem biến tính ở nhiệt độ 94oC trong 3 phút (Tiến hành bước này bằng máy PCR) và sau đó ngay lập tức vùi mẫu sâu vào trong đá
Tra 2-3,5µl mẫu (Đã được trộn sẵn với loading dye 6X) vào mỗi giếng. Marker 100bp thường sẽđược tra vào giếng đầu tiên và giếng cuối cùng của bản gel.
Đóng nắp bể trên và bể dưới. Cài đặt chạy khoảng 100-200V, 50W trong khoảng 3h.
► Nhuộm bạc
a. Hóa chất nhuộm
1. 1000ml dung dịch cố định gel ( Fix/Stop solution):
Acetic Acid (100ml) + dH2O (900ml). Dung dịch này được trữ trong lọ thủy tinh bình thường, và bảo quản ở nhiệt độ phòng.
2. 1000ml dung dịch nhuộm gel (Staining solution):
AgNO3 (1g) + dH2O (1000ml), hỗn hợp dung dịch này cần pha thật nhanh để tránh ánh sang phân hủy và được bảo quản ở nhiệt độ phòng trong lọ tối màu. Trước khi nhuộm mẫu khoảng 5 phút, ta sẽ thêm 1,5ml HCHO37% vào.
3. 1000ml dung dịch phát tiển màu (Developing solution):
Na2CO3 (30g) + dH2O (1000ml), hỗn hợp dung dịch này được bảo quản trong điều kiện đông đá, ở chai tối màu. Trước khi sử dụng khoảng 5 phút ta sẽ thêm 200µl sodium thiosulphate 10mg/ml và 1,5ml HCHO 37%.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 35
◘ Bước 1: Đặt miếng kính nhỏ có bản gel vào khay sao cho gel ở trên
◘ Bước 2: Cho dung dịch cố định gel vào lắc trong 20 phút sau đó bỏ dung dịch cốđịnh gel vào lại bình để sử dụng tiếp sau này.
◘ Bước 3: Cho 1000ml nước vào khay lắc trong 2 phút, bỏ nước ◘ Bước 4: Lặp lại 2 lần với bước rửa bằng nước.
◘ Bước 5: Cho dung dịch nhuộm vào khay lắc trong 30 phút. Bỏ dung dịch nhuộm lại lọ.
◘ Bước 6: Rửa dung dịch nhuộm dính ở mẫu bằng nước trong 5-10 giây ◘ Bước 7: Đổ dung dịch phát triển màu vào và lắc đến khi màu băng vạch màu vàng nhạt xuất hiện.
◘ Bước 8: Thêm dung dịch cốđịnh màu vào và lắc trong 3 phút ◘ Bước 9: Rửa 2 lần với nước
◘ Bước 10: Giữ khô qua đêm ở nhiệt độ phòng. Các bước tiến hành được thể hiện ở hình 2.3.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 36 Hình 2.3. Cách tiến hành nhuộm Gel Lắc 20 phút Dung dịch cố định gel X 2 lần