Sản phẩm Microsatellite được kiểm tra trên gel polyacrylamide 4,5%, chạy với dung dịch đệm TBE 1X.
► Xử lý kính
♦ Bước 1: Rửa sạch cả 2 tấm kính bằng dung dịch xà phòng sau đó tráng sạch với nước.
♦ Bước 2: Lau khô sau đó làm sạch cả 2 tấm kính bằng cồn tuyệt đối, để khô trong 5 phút.
♦ Bước 3: Xử lý tấm kính nhỏ: lau kính nhỏ với dung dịch binding solution (EtOH 95% 1ml, Acetic acid 5µl, γmethacryloxy propyl trimoethoxylane 3µl) và để khô. ♦ Bước 4: Gắn 2 tấm kính sao cho 2 mặt kính sạch đối diện nhau tạo thành sandwiches plates.
►Chuẩn bị gel 60ml polyacrylamide 4.5%
Lấy 60 ml 4,5% acrylamide (bao gồm 6,74 ml acrylamide gel (19:1), 25,2g Urea, 6ml TBE10x, và thêm nước đến 60ml) cho vào 1 cốc 100ml.
Chuẩn bị 0,25% ammonium persulphate: cân 0,025mg của ammonium persulphate cho vào ống Eppendord, và thêm 100µl H2O.
Thêm 60µl TEMED và 60µ 0,25% ammonium persulphate vào dung dịch gel và khuấy đều.
Đặt 2 tấm kính đã xử lý ở trên nghiêng 1 góc 45o, dùng xi lanh hút hết dung dịch gel và nhỏ từ từ vào khe giữa 2 tấm kính sao cho không tạo bọt khí bên trong gel. Gắn lược tạo giếng.
Để gel đông kết khoảng 1 giờ.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34 Khi gel đã khô, tháo lược và gắn bản gel vào trong máy điện di.
Đổ TBE1x vào bể trên tới vạch qui định
Đổ TBE1x vào bể dưới sao tới khi chạm tới gel
Đóng nắp bể trên và bể dưới. Chạy tiền khởi ởđiện thế 100W, 20V trong 30 phút để làm nóng bản gel.
► Điện di
Khoảng 10 phút trước khi kết thúc quá trình chạy tiền khởi ở trên, chúng ta sẽ chuẩn bị mẫu để tra vào giếng chạy điện di.
Ly tâm mẫu và đem biến tính ở nhiệt độ 94oC trong 3 phút (Tiến hành bước này bằng máy PCR) và sau đó ngay lập tức vùi mẫu sâu vào trong đá
Tra 2-3,5µl mẫu (Đã được trộn sẵn với loading dye 6X) vào mỗi giếng. Marker 100bp thường sẽđược tra vào giếng đầu tiên và giếng cuối cùng của bản gel.
Đóng nắp bể trên và bể dưới. Cài đặt chạy khoảng 100-200V, 50W trong khoảng 3h.
► Nhuộm bạc
a. Hóa chất nhuộm
1. 1000ml dung dịch cố định gel ( Fix/Stop solution):
Acetic Acid (100ml) + dH2O (900ml). Dung dịch này được trữ trong lọ thủy tinh bình thường, và bảo quản ở nhiệt độ phòng.
2. 1000ml dung dịch nhuộm gel (Staining solution):
AgNO3 (1g) + dH2O (1000ml), hỗn hợp dung dịch này cần pha thật nhanh để tránh ánh sang phân hủy và được bảo quản ở nhiệt độ phòng trong lọ tối màu. Trước khi nhuộm mẫu khoảng 5 phút, ta sẽ thêm 1,5ml HCHO37% vào.
3. 1000ml dung dịch phát tiển màu (Developing solution):
Na2CO3 (30g) + dH2O (1000ml), hỗn hợp dung dịch này được bảo quản trong điều kiện đông đá, ở chai tối màu. Trước khi sử dụng khoảng 5 phút ta sẽ thêm 200µl sodium thiosulphate 10mg/ml và 1,5ml HCHO 37%.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 35
◘ Bước 1: Đặt miếng kính nhỏ có bản gel vào khay sao cho gel ở trên
◘ Bước 2: Cho dung dịch cố định gel vào lắc trong 20 phút sau đó bỏ dung dịch cốđịnh gel vào lại bình để sử dụng tiếp sau này.
◘ Bước 3: Cho 1000ml nước vào khay lắc trong 2 phút, bỏ nước ◘ Bước 4: Lặp lại 2 lần với bước rửa bằng nước.
◘ Bước 5: Cho dung dịch nhuộm vào khay lắc trong 30 phút. Bỏ dung dịch nhuộm lại lọ.
◘ Bước 6: Rửa dung dịch nhuộm dính ở mẫu bằng nước trong 5-10 giây ◘ Bước 7: Đổ dung dịch phát triển màu vào và lắc đến khi màu băng vạch màu vàng nhạt xuất hiện.
◘ Bước 8: Thêm dung dịch cốđịnh màu vào và lắc trong 3 phút ◘ Bước 9: Rửa 2 lần với nước
◘ Bước 10: Giữ khô qua đêm ở nhiệt độ phòng. Các bước tiến hành được thể hiện ở hình 2.3.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 36 Hình 2.3. Cách tiến hành nhuộm Gel Lắc 20 phút Dung dịch cố định gel X 2 lần dH2O Dung dịch cố định gel Lắc 2 phút Dung dịch nhuộm bạc ddH2O Lắc 30 phút dH2O Lắc 5-10s Dung dịch nhuộm bạc Dung dịch phát triển màu ddH2O Lắc tới khi băng vạch xuất hiện màu vàng Dung dịch cốđịnh màu Dung dịch phát triển màu Lắc 3 phút X 2 lần dH2O Dung dich cốđịnh màu Dung dịch cố định gel
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 37