2.1.1.1 Thời gian
Đề tài đƣợc thực hiện từ 09/2012 đến tháng 07/2014.
2.1.1.2 Địa điểm
Các thí nghiệm đƣợc thực hiện tại phòng Sinh học đất - Bộ môn Khoa học đất - khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng - trƣờng Đại học Cần Thơ.
2.1.1.3 Nội dung nghiên cứu
Khảo sát tình hình sử dụng thuốc trừ cỏ chứa hoạt chất Butachlor trên mô hình luân canh lúa - màu tại 3 huyện Bình Tân - VL, Cai Lậy - TG và Chợ Mới - An Giang.
Trên mô hình luân canh lúa - màu thu mẫu ở 13 ruộng gồm có: 4 ruộng ở huyện Cai Lậy - TG, 4 ruộng ở Bình Tân - VL và 5 ruộng ở Chợ Mới - AG. Trong đó, huyện Cai Lậy thu đƣợc 4 mẫu đất trong giai đoạn trồng màu và 1 mẫu đất trong giai đoạn trồng lúa, ở Chợ Mới thu đƣợc 4 mẫu đất trong giai đoạn trồng màu và 3 mẫu đất trong giai đoạn trồng lúa và ở Bình Tân thu đƣợc 4 mẫu đất trong giai đoạn trồng màu và 4 mẫu đất trong giai đoạn trồng lúa. Tất cả các mẫu đất dùng để thực hiện thí nghiệm phân lập vi khuẩn phân hủy thuốc Butachlor đều là đất phù sa.
Đánh giá khả năng phân hủy Butachlor của từng nhóm vi khuẩn phân lập đƣợc trong môi trƣờng dung dịch khoáng tối thiểu.
Sử dụng kỹ thuật DGGE để so sánh đa dạng về mặt di truyền của hệ vi khuẩn hiếu khí phân hủy Butachlor phân lập ở vụ trồng lúa so với vụ trồng màu từ một ruộng và sự đa dạng về mặt di truyền của hệ vi khuẩn giữa lúc trồng màu với nhau khi khác ruộng trên mô hình luân canh lúa – màu.
14
Hình 2.1 Các địa điểm thu mẫu tại Cai Lậy - TG, Chợ Mới - AG và Bình Tân – VL 2.1.2 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
Dụng cụ thu mẫu: khoan, leng, cuốc, túi nilông, túi đựng, giấy nhôm... dùng để thu mẫu đất.
Các dụng cụ thí nghiệm: cốc thủy tinh, ống đong, bình tam giác, đĩa petri, ống nghiệm, lọ bi... dùng cho quá trình nuôi cấy, phân lập vi khuẩn và bố trí thí nghiệm.
Thiết bị thực hiện thí nghiệm: Nồi hấp khử trùng ƣớt, tủ sấy, máy lắc, máy li tâm, tủ hút, máy vortex, tủ lạnh các loại 4o
C, tủ đông -20, -80. Máy sắc ký lỏng khối phổ HPLC – dùng để phân tích thuốc Butachlor. Máy GeneAmp® PCR System 9700 chạy PCR dùng để nhân chuỗi DNA. Máy BIO-RAD DcodeTM System để chạy điện di biến tính tăng cấp DGGE, đánh giá sự đa dạng của vi khuẩn phân hủy thuốc Butachlro trên mô hình luân canh lúa - màu. Hệ thống chụp ảnh Gel Logic 1500 Imaging System của hãng Kodak, dùng để chụp ảnh gel chứa DNA và các thiết bị thí nghiệm khác.
Chợ Mới - AG
15
2.1.3 Môi trƣờng nuôi cấy và hóa chất thí nghiệm
Môi trường nuôi cấy bao gồm:
Môi trƣờng khoáng tối thiểu (MM-Mineral minimal medium) gồm có 870 ml nƣớc khử khoáng đƣợc khử trùng ƣớt ở 121oC trong 20 phút, khi nhiệt độ hạ xuống còn 70oC thêm vào 25 ml dung dịch đệm, 100 ml dung dịch muối khoáng và 5 ml dung dịch vi lƣợng, nuôi cấy vi khuẩn với Butachlor 20 ppm (0,002%). Thành phần của các dung dịch trên đƣợc trích dẫn trong Phụ chƣơng 1.
Môi trƣờng Tryptose Soybean Agar (TSA) gồm 30 g Tryptone Soya Broth (TSB), 15 g Agar pha trong một lít nƣớc khử khoáng để phân lập các dòng vi khuẩn từ các cộng đồng.
Các hóa chất dùng trong thí nghiệm gồm có:
Thuốc Butachlor tinh khiết (99%) của Dr. Ehrenstorfer (Augsburg, Germany).
Chất chuẩn Butachlor của Accustandard làm đƣờng chuẩn phân tích thuốc trên HPLC và xác định peak của Butachlor khi phân tích.
Các loại dung môi có độ tinh khiết cao nhƣ Acetone (99,8%), Toluene (99,9%), trích thuốc BVTV Butachlor từ dung dịch. Acetone (99,8%), đƣợc dùng để pha thuốc Butachlor khi nuôi cấy vi khuẩn của hãng J.T.Baker.
Hóa chất trích DNA vi khuẩn: DNA vi khuẩn đƣợc trích bằng phƣơng pháp CTAB 3% .
Hóa chất thực hiện phản ứng PCR nhận diện vi khuẩn: Sử dụng các hóa chất trong bộ Kit PCR, bao gồm: Hỗn hợp Go Taq Green Master Mix (Promega), mồi xuôi 341F- GC với trình tự mồi là : CGC CCG CCG CGC GC GGC GGG CGG GGC GG GGG CAC GGG GGG C..., mồi ngƣợc 534R với trình tự mồi là: ATT ACC GCG GCT GC TGG, nƣớc tinh sạch enzyme Nuclease.
Hóa chất chuẩn bị chạy gel Agarose kiểm tra sản phẩm PCR: Agarose 1,5% (Merck), TAE buffer 0.5X, Loading buffer (chất chỉ thị màu - LB), Ethidium bromide (chất chỉ thị huỳnh quang-EtBr), thang chuẩn DNA từ 100 - 1000 bp, nấc 100 bp của hãng Fermentas.
Hóa chất chuẩn bị chạy điện di biến tính tăng cấp DGGE: Chất nhuộm 2X, tris base Acetate 50X, dung dịch biến tính gồm có: urea 42%, Acrylamide 40%,
16
Ammonium persulfate 10% ((ASP), TEMED, nƣớc, Butanol). Thành phần của các dung dịch trên đƣợc trích dẫn trong Phụ chƣơng 2.
2.2 Phƣơng pháp
2.2.1 Khảo sát tình hình sử dụng thuốc trừ cỏ có chứa hoạt chất Butachlor trên mô hình luân canh lúa - màu tại một số huyện thuộc ĐBSCL mô hình luân canh lúa - màu tại một số huyện thuộc ĐBSCL
Khảo sát tình hình sử dụng thuốc trừ cỏ có chứa hoạt chất Butachlor trên mô hình luân canh lúa - màu đƣợc thực hiện tại các xã thuộc huyện Cai Lậy - TG, Bình Minh, Bình Tân - VL và Chợ Mới - AG. Tại Cai Lậy điều tra 5 hộ, ở Bình Tân 27 hộ và ở Chợ Mới 16 hộ. Việc khảo sát điều tra dựa vào bảng câu hỏi điều tra, chủ yếu thu thập thông tin về tình hình sử dụng bao gồm loại thuốc sử dụng, liều lƣợng/vụ, lƣợng thuốc/năm, % diện tích phun thuốc trên tổng diện tích điều tra. Các hộ đƣợc điều tra, phỏng vấn đƣợc lựa chọn một cách ngẫu nhiên và cách xa nhau để tránh hiện tƣợng sử dụng thuốc giống nhau giữa các hộ trong các huyện khảo sát. Mẫu phiếu điều tra chi tiết đƣợc trình bày ở Phụ chƣơng 3.
Hình 2.2 Điều tra tình hình sử dụng thuốc BVTV
2.2.2 Phân lập vi khuẩn phân hủy Butachlor trên mô hình luân canh lúa - màu
Các mẫu đất đƣợc lấy ngẫu nhiên trên các hộ đã phỏng vấn nhằm đánh giá sự đa dạng của vi khuẩn phân hủy thuốc Butachlor trên mô hình luân canh lúa - màu ở huyện Bình Tân - VL, huyện Cai Lậy - TG và huyện Chợ Mới - AG. Danh sách các hộ thu mẫu đƣợc liệt kê tại Phụ chƣơng 4. Các mẫu đất dùng để phân lập đƣợc trình bày ở bảng sau:
17
Bảng 2.1 Số lƣợng mẫu đất dùng để phân lập tại các huyện Bình Tân, Cai Lậy và Chợ Mới
Mô hình lúa – màu Địa điểm Số lƣợng mẫu đất
Vụ lúa Cai Lậy 1 Chợ Mới 3 Bình Tân 4 Vụ màu Cai Lậy 4 Chợ Mới 4 Bình Tân 4
Tất cả 20 mẫu đất đƣợc lấy ở độ sâu 0-10 cm. Mỗi ruộng lấy ngẫu nhiên 5 vị trí khác nhau, sau đó trộn đều bảo quản bằng giấy nhôm và bọc nilon ở nhiệt độ phòng. Tại mỗi ruộng khác nhau, các dụng cụ đƣợc rửa sạch và tiệt trùng bằng cồn 70 độ. Đất đƣợc lấy về đƣợc trộn đều, cân 10 g cho vào chai thủy tinh 250 ml có nắp đậy, bổ sung 100 ml dung dịch đệm phosphate đã tiệt trùng (23,99 g NaH2PO4 và 15,59 g Na2HPO4 cho 1 lít nƣớc khử khoáng), lắc với tốc độ 130 vòng/phút trong 1 giờ, để lắng 15 phút sau đó hút 1ml dung dịch trên cho vào các bình tam giác đã chuẩn bị sẵn 24 ml môi trƣờng MM với pH = 7,2 có chứa thuốc Butachlor 0,002% (20 ppm) và Butachlor đƣợc xem nhƣ là nguồn carbon duy nhất. Các bình tam giác trên đƣợc lắc liên tục trên máy lắc với tốc độ 90 vòng/phút (nhằm tạo khả năng trao đổi oxy tốt cho dung dịch khi lắc) ở nhiệt độ phòng thí nghiệm và trong tối. Đây đƣợc xem là thế hệ nuôi cấy đầu tiên. Sau 6 đến 8 ngày nuôi cấy, hút 1 ml dung dịch vi khuẩn của thế hệ nuôi cấy đầu tiên cho vào bình tam giác 100 ml tiệt trùng chứa 24 ml dung dịch môi trƣờng khoáng tối thiểu chứa 20 ppm Butachlor. Tiếp tục nuôi cấy trên máy lắc, trong tối và trong điều kiện phòng thí nghiệm trong khoảng 6- 8 ngày. Toàn bộ qui trình đƣợc thực hiện liên tục trong 5 lần. Tuy nhiên, sau thế hệ nuôi cấy thứ hai chỉ cần quan sát và theo dõi độ đục của môi trƣờng.
Sau khi xác định đƣợc các cộng đồng phân hủy Butachlor thì thực hiện phân lập các dòng vi khuẩn từ những cộng đồng phân hủy Butachlor. Việc phân lập đƣợc tiến hành bằng cách cấy vi khuẩn đƣợc làm giàu trên môi trƣờng tryptose soybean agar (TSA) và các bƣớc phân lập đƣợc thực hiện nhƣ sau:
Sử dụng dung dịch chứa cộng đồng vi khuẩn hiếu khí đã phân hủy thuốc đã đƣợc làm giàu mật số trƣớc đó. Sau đó hút 100 ul dung dịch mẫu gốc đem pha loãng với nƣớc khử khoáng theo nồng độ pha loãng 10-4 và 10-5
.
Hút 50 ul dung dịch huyền phù vi sinh vật đã pha loãng cho vào môi trƣờng TSA, dùng que chà trãi đều trên bề mặt đĩa đến khi môi trƣờng bề mặt khô sau
18
đó các đĩa này đƣợc ủ kín trong điều kiện không có ánh sáng và giữ ở nhiệt độ phòng.
Hình 2.3 Quy trình làm giàu mật số vi khuẩn từ đất
Sau 5 ngày ủ các khuẩn lạc xuất hiện trên bề mặt môi trƣờng TSA và phân dạng vi khuẩn dựa vào hình thái quan sát đƣợc. Từng khuẩn lạc quan sát đƣợc tách ròng trên môi trƣờng TSA để kiểm tra sự đồng nhất của các khuẩn lạc. Mỗi khuẩn lạc đƣợc kiểm tra độ đồng nhất hình thái lần nữa thông qua 4 lần nuôi cấy trên đĩa môi trƣờng TSA.
Các dòng vi khuẩn sau khi phân lập đƣợc xem là dòng thuần và đƣợc tiến hành khảo sát các đặc tính hình thái khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn theo các đặc tính:
- Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn đƣợc mô tả theo Gerhardt và ctv. (1994). - Hình dạng tế bào vi khuẩn và kiểm tra gram vi khuẩn đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp của Suslow và ctv. (1982).
2.2.3 Khảo sát khả năng phân hủy thuốc Butachlor của các cộng đồng và các dòng vi khuẩn phân lập từ đất luân canh lúa - màu dòng vi khuẩn phân lập từ đất luân canh lúa - màu
Tất cả 20 mẫu đất đƣợc lấy trên mô hình luân canh lúa - màu gồm có 12 mẫu đất lấy ở vụ màu và 8 mẫu đất lấy ở vụ lúa. Các mẫu đất này đƣợc làm giàu mật số cộng đồng vi khuẩn trong môi trƣờng khoáng tối thiểu với Butachlor ở nồng độ 20 ppm. Sau
19
5 lần đƣợc làm mật số, các cộng đồng vi khuẩn này đƣợc thực hiện thí nghiệm để khảo sát khả năng phân hủy Butachlor ở nồng độ 20 ppm trong môi trƣờng khoáng tối thiểu với 2 nghiệm thức và 4 lần lặp lại. Sau 28 ngày nuôi cấy, hàm lƣợng Butachlor còn lại trong dịch nuôi đƣợc phân tích trên máy HPLC.
Nghiệm thức 1: Môi trƣờng dung dịch MM có chứa Butachlor ở nồng độ 20 ppm và 50 µl dịch nuôi chứa vi khuẩn.
Nghiệm thức 2: Môi trƣờng dung dịch MM và Butachlor ở nồng độ 20 ppm. Khảo sát khả năng phân hủy Butachlor của 20 cộng đồng vi khuẩn, có 3 cộng đồng vi khuẩn phân hủy tốt Butachlor đƣợc chọn để phân lập là BT50L và CL4M (hai cộng đồng vi khuẩn này đƣợc lấy ở vụ màu) và BT50L đƣợc lấy ở vụ lúa. Trong đó BT50L (vụ lúa) và BT50M (vụ màu) đƣợc thu mẫu từ một ruộng luân canh lúa - màu, cộng đồng BT50M phân lập đƣợc 15 dòng và gom thành 3 nhóm, BT50L phân lập đƣợc 20 dòng và gom thành 4 nhóm và CL4M phân lập đƣợc 17 dòng và gom thành 3 nhóm (Danh sách các nhóm đƣợc trình bày ở Phụ chƣơng 5). Trong đó mỗi nhóm với 5 hoặc 6 dòng/nhóm, các dòng trong một nhóm đƣợc lựa chọn một cách ngẫu nhiên và không có dòng nào trùng lại giữa các nhóm của một cộng đồng. Sau đó 10 nhóm này đƣợc thực hiện thí nghiệm để khảo sát khả năng phân hủy Butachlor ở nồng độ 20 ppm trong môi trƣờng khoáng tối thiểu với 2 nghiệm thức và 4 lần lặp lại. Sau 32 ngày nuôi cấy, hàm lƣợng Butachlor còn lại trong dịch nuôi đƣợc phân tích trên máy HPLC.
Nghiệm thức 1: Môi trƣờng MM có chứa Butachlor ở nồng độ 20 ppm và vi khuẩn.
Nghiệm thức 2: Môi trƣờng MM chứa Butachlor ở nồng độ 20 ppm.
Trên đĩa môi trƣờng TSA, các khuẩn lạc đƣợc cấy trực tiếp cho vào môi trƣờng MM bằng cách dùng que chấm nhẹ vào khuẩn lạc đó rồi cho vào dung dịch MM.
2.2.4 So sánh sự đa dạng của hệ vi khuẩn phân lập từ đất vụ trồng lúa và đất vụ trồng màu của mô hình luân canh lúa - màu trồng màu của mô hình luân canh lúa - màu
Để so sánh sự đa dạng của hệ vi khuẩn hiếu khí phân lập đƣợc từ đất vụ trồng lúa và vụ trồng màu của mô hình luân canh lúa - màu. Phƣơng pháp đƣợc thực hiện nhƣ sau: Trên đĩa môi trƣờng TSA có chứa các dòng vi khuẩn, sau đó dùng que cấy chấm từ 5-6 khuẩn lạc trên đĩa môi trƣờng TSA (các dòng đƣợc gom theo từng nhóm tƣơng ứng với từng cộng đồng) cho vào evendop 1,5 ml và các hệ vi khuẩn này đƣợc thực hiện hiện trích DNA bằng phƣơng pháp CTAB 3% (phụ chƣơng 6). DNA của vi khuẩn sau khi đƣợc trích sẽ đƣợc thực hiện phản ứng PCR cho gene 16S rRNA với mồi tổng
20
quát 341F/534R (phụ chƣơng 7). Sau đó kiểm tra sản phẩm PCR bằng phƣơng pháp diện di Agrarose (phụ chƣơng 8) và cuối cùng là thực hiện phƣơng pháp điện di biến tăng cấp DGGE và đƣợc phân tích độ tƣơng đồng (phụ chƣơng 2).
2.2.5 Phƣơng pháp trích Butachlor trong môi trƣờng nuôi cấy
Phƣơng pháp trích Butachlor từ dung dịch nuôi cấy đƣợc thực hiện nhƣ sau: Chuyển 4 ml dung dịch nuôi cấy từ ống nghiệm sang lọ bi 12 ml, tráng ống nghiệm ba lần bằng 4 ml hỗn hợp toluen và acetone (2:1), tất cả dung môi tráng đều cho vào lọ bi. Vortex với vận tốc 2.500 vòng/phút, sau đó ly tâm với tốc độ 2.500 vòng/phút trong 2 phút, hút phần dung môi tách lớp bên trên cho vào lọ bi mới. Toàn bộ qui trình trích này đƣợc lặp lại ba lần để đạt hiệu suất trích cao. Lƣợng dung môi chứa Butachlor sau ba lần trích đƣợc gộp chung lại trong một lọ bi.
Hình 2.4 Phân tích mẫu bằng máy HPLC và thời gian lƣu peak thuốc Butachlor
Phƣơng pháp phân tích trên HPLC đƣợc sử dụng theo phƣơng pháp Liu Zhong – zheng et al., 2010 và đƣợc thực hiện nhƣ sau: Các mẫu dịch trích đƣợc đƣa về thể tích 10 ml. Sau đó đƣợc phân tích hàm lƣợng thuốc Butachlor còn lại trong dung dịch bằng phƣơng pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC), sử dụng cột C18 (dài: 250MM, đƣờng kính trong: 4.6 mm), tỷ lệ pha động Acetonitrile: nƣớc 70:30, bƣớc sóng 215nm, lƣu lƣợng pha động 1ml/phút, thể tích hút mẫu 10 μl, thời gian lƣu peak của Butachlor ở 19,049 phút.
2.2.6 Phƣơng pháp trích DNA của vi khuẩn từ khuẩn lạc
Đối với các dòng vi khuẩn đƣợc trích DNA bằng phƣơng pháp CTAB 3%. Tiến hành trích DNA của vi khuẩn theo các bƣớc của quy trình (phụ chƣơng 6). DNA sau khi trích sẽ đƣợc tiến hành phản ứng chuỗi Polymerase và điện di biến tính tăng cấp để
21
đánh giá sự đa dạng của vi khuẩn hiếu khí có khả năng phân hủy Butachlor trên mô hình luân canh lúa - màu.
2.2.7 Thực hiện phản ứng PCR cho gene 16s RNA
Các dòng vi khuẩn sau khi đƣợc trích DNA sẽ chạy với mồi tổng quát 341F/534R để khuếch đại đoạn gene 16S rRNA. Qui trình chạy PCR đƣợc trích dẫn ở phụ chƣơng 7.
2.2.8 Phƣơng pháp điện di Agarose kiểm tra sản phẩm PCR
Phƣơng pháp này dƣạ vào đặc tính tích điện âm của các axit nucleic. Dƣới tác động của dòng điện một chiều các axit nucleic sẽ di chuyển từ âm sang dƣơng. Các sản phẩm DNA vi khuẩn sau khi đã khuếch đại bằng phản ứng PCR sẽ tiếp tục đƣợc diện di trên trên gel agarose 1,5% (wt/vol) với 6X loading buffer (LB) ở hiệu điện thế 150