2.1.2.1. Phương pháp bào chê và đóng nang viên nén mini Captopril tác dụng kéo dài
Viên n é n m in i C ap to p ril TDKD được b à o chế b ằ n g phương p h á p xát h ạ t
ướt:
Các n g u y ê n liệu: Captopril, AcA, DNE, EC, la c t o s e được cân th e o
công thức và trộn đều theo nguyên tắc trộn bột kép.
Hỗn hợp bột đem tạo khối ẩm bằng dung dịch EC 2% trong ethanol.
^ Xát hạt qua rây 0,6 mm.
^ Sấy hạt ở 50°c đến độ ẩm 2-3%.
Sửa hạt khô qua rây 0,6 mm rồi trộn hạt vói tá dược trơn.
Đem dập viên với chày, cối có đường kính (|) = 4,5 mm. Độ cứng viên 3-4 kP. Khối lượng viên 42 mg. Cứ 10 viên đóng vào 1 nang cứng số 0. Hàm lượng captopril của một viên nang là 25mg.
2.1.2.2. Phương pháp bao viên
♦> Thiết b ị: nồi bao có gắn bộ phận súng phun dịch bao và thổi khí nóng. ♦♦♦ Tiến hành
^ Tính toán khối lượng EC và công thức màng bao theo lượng EC: Q = L . A . 10‘2. n . a (mg)
Q : Khối lượng EC cho mẻ sản xuất với n viên. A : Diện tích bề mặt của một viên (min2).
L : Số mg EC trên 1 cm2 bề mặt (mg/cm2).
Hư hao trong quá trình bao là 20% => a = 1,2. Pha chế dịch bao theo công thức.
^ Chuẩn bị: viên được sàng cho hết bụi bám trên bề mặt, loại bỏ
những viên có khuyết tật. Nồi bao được đặt nghiêng so với phương thẳng đứng một góc 45°, quay với tốc độ 40 vòng/phút. Cho viên vào nồi bao quay và thổi khí nóng 15 phút để viên nóng.
^ Tiến hành phun dịch bao với tốc độ khoảng 2 ml/phút. Khi phun hết dịch bao, cho nồi quay tiếp 1 5 -3 0 phút để màng bao khô hoàn toàn. Lấy viên ra, đóng vào nang.
2.1.2.3. Phương pháp định lượng captopril trong các mẫu viên nang
Áp dụng theo chuyên luận viên nén captopril - USP26, hàm lượng captopril trong các mẫu viên được xác định bằng phương pháp HPLC.
❖ Dung dịch chuẩn: Cân một lượng chính xác A (mg) captopril (khoảng 50 mg), chuyển vào bình định mức 50 ml. Thêm khoảng 30 ml pha động, lắc đều trên máy lắc trong 15 phút. Thêm pha động đến vạch, lắc đều. Lọc qua giấy lọc, bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Dịch lọc đem lọc lại qua màng lọc 0,45 ịim.
❖ Dung dịch định lượng: Cân c h ín h xác khối lượng v iê n nén mini đóng trong 10 viên nang, tính khối lượng trung bình M của một nang. Nghiền các viên nén mini đóng trong 10 viên nang thành bột mịn. Cân chính xác m (mg) bột viên tương ứng khoảng 50 mg captopril, chuyển vào bình định mức 50 ml. Thêm khoảng 30 ml pha động, lắc đều trên máy lắc trong 15 phút. Thêm pha động đến vạch, lắc đều. Lọc qua giấy lọc, bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Dịch lọc đem lọc lại qua màng lọc 0,45 |j.m.
♦♦♦ Điều kiện sắc ký:
Pha động : Hỗn hợp gồm 550 ml methanol và 450 ml nước cất hai lần có chứa 0,5 ml acid phosphoric đã được lọc và đuổi hết khí hoà tan.
^ Tốc độ dòng: lml/phút.
^ Cột sắc ký: Apollo C18 250 mm X 4,6 mm, 5 Jim (Alltech-Mỹ). ^ Detector : PDA với bước sóng X = 220 nm.
hệ thống sắc ký. Ghi lại sắc ký đồ và diện tích pic captopril của dung dịch
c h u ẩ n v à d u n g d ịc h th ử .
Hàm lượng captopril trong một viên nang được tính theo công thức:
H ì = ỉ ^ , - M ^
Trong đó: Rt : diện tích pic captopril của dung dịch thử.
Rc\ diện tích pic captopril của dung dịch chuẩn.
2.1.2.4. Phương pháp thử khả nàng giải phóng captopril từ viên nang chứa các viên nén mini
Khảo sát khả năng giải phóng của captopril từ viên nang chứa các viên nén mini theo chuyên luận "Viên nén captopril" được ghi trong ƯSP26.
Sử dụng máy trắc nghiệm hoà tan Vankel (máy 6 cốc cánh khuấy) để đánh giá lượng captopril giải phóng sau những khoảng thòi gian xác định, với các thông số:
^ Môi trường : 900 ml dung dịch acid hydrocloric 0,0IN.
Nhiệt độ : 37 ± 0,5°c
Tốc độ cánh khuấy : 50 ± 2 vòng/phút.
Các bước tiến hành:
Cho nước cất vào bể điều nhiệt, lắp các thiết bị và khởi động máy, đợi cho máy ổn định và đạt thông số yêu cầu.
^ Cho viên nang vào môi trường hoà tan trong cốc.
^ Sau những khoảng thời gian xác định lh, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h, 7h, 8h hút chính xác 5 ml môi trường hoà tan trong cốc vào ống nghiệm. Bổ sung 5
m l m ô i trư ờn g vào các cốc.
^ Li tâm các ống nghiệm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút. Hút lấy phần dịch trong, lọc qua màng lọc 0,45 |Lim.
^ Định lượng captopril trong dịch lọc bằng phương pháp HPLC với các điều kiện tương tự như trong mục 2.1.2.3.
Xác định phần trăm captopril giải phóng tại các thời điểm bằng phương pháp so sánh diện tích pic captopril của các mẫu thử với diện tích pic captopril của mẫu chuẩn có nồng độ biết trước.
2.1.2.5. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ tá dược đến phần trăm giải phóng và tôi ưu hoá công thức bào chế viên nén mini Captopril
a> Phương pháp thiết k ế thí nghiệm: thiết kế theo mô hình mặt hợp tử tại tâm với sự hỗ trợ của phần mềm Modde 5.0.
b> Phương pháp đánh giá ảnh hưởng: xử lý số liệu và đánh giá nhờ mạng thần kinh nhân tạo với sự hỗ trợ của phần mềm ANNA 1.4.
c> Phương pháp tối ưu hóa: xử lý kết quả bằng phần mềm ANNA 1.4 và tìm điều kiện tối ưu bằng phần mềm OPTTM 1.4.
2.2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT
2.2.1. Khảo sát điều kiện sắc ký để định lượng captoprỉl
Theo chuyên luận "viên nén captopril" trong USP26, hàm lượng captopril trong các mẫu dung dịch được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Tuy nhiên trong công thức viên nén mini, chúng tôi dự kiến đưa AcA và DNE vào với mục đích chống oxy hoá. Thêm vào đó, chiều dài và đường kính cột sắc ký không giống hoàn toàn so với USP26 nên
c h ú n g t ô i t iế n h à n h g h i sắ c k ý đ ồ v à k h ả o s á t k h ả n ă n g tá c h p ic C ap top ril so
với AcA, DNE và tạp chất phân huỷ.
2.2.1.1. Khảo sát khả năng tách của captopril với AcA và DNE
Bố trí các điều kiện sắc ký như sau:
❖ Pha động : hỗn hợp gồm 550 ml methanol và 450 ml nước cất hai lần có chứa 0,5 ml acid phosphoric đã được lọc và đuổi khí.
❖ Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
❖ Cột sắc ký: Apollo C18 250 mm X 4,6 mm, 5 |um (Alltech- Mỹ). ♦> Detector. PDA với bước sóng X = 220 nm.
❖ Bơm mẫu: tiến hành bơm mẫu tự động, mỗi lần bơm 10 |nl. Mẫu 1: dung dịch captopril có nồng độ 1 mg/ml
Mẫu 2: dung dịch AcA, DNE có nồng độ lần lượt 5 và 1 mg/ml. Mẫu 3: dung dịch captopril có nồng độ 1 mg/ml, AcA 5 mg/ml và DNE 1 mg/ml.
Các mẫu này được pha trong pha động và lọc qua màng lọc 0,45 ịxm. *1* Thời gian phân tích một mẫu: dự tín h là 12 phút.
Sau khi phân tích mẫu, ghi lại sắc ký đồ (hình 3, 4, 5).
Nhận xét:
Dựa vào các sắc ký đồ ghi lại được, chúng tôi nhận thấy:
^ Ở sắc ký đồ của mẫu 1, chỉ có một pic có thời gian lưu là 4,58 phút chứng tỏ đây là pic của captopril.
^ Trong sắc ký đồ của mẫu 2, chỉ có một pic có thời gian lưu là 2,5 phút, ngoài ra không còn pic nào xuất hiện nữa, đặc biệt ở thời điểm 4,58 phút. Do ở bước sóng 220 nm, DNE không hấp thụ tử ngoại nên đây là pic của AcA.
Với mẫu 3, hai pic của captopril và AcA xuất hiện tách biệt nhau, và pic của AcA tr ù n g với pic dung môi.
=> Như vậy ở điều kiện sắc ký như trên thì hai pic của captopril và AcA tách nhau hoàn toàn trong đó pic của AcA và captopril có thời gian lưu lần lượt là 2,5 và 4,58 phút.
Minutes
Hinh 3: Sac ky do cüa mâu 1.
__ Linh-220nm o cap_ondinh
Rétention Time (fi
Name « TJ '8 i 5? csi 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Minutes
Hinh 4: Sac ky do cüa mâu 2.
Minutes
2.2.1.2. Khảo sát khả năng tách của captopril với tạp chất phân huỷ
Theo ƯSP26, điều kiện sắc ký để định lượng captopril phải đảm bảo độ phân giải của pic captopril và pic tạp captopril disulíit lớn hơn 2. Tuy nhiên, do không có chất chuẩn captopril disulíit để so sánh nên chúng tôi tiến hành như sau: phân huỷ captopril bằng cách pha dung dịch captopril 1 mg/ml trong môi trường dịch ruột nhân tạo không có pancreatin và đặt mẫu trong nồi cách thuỷ ở nhiệt độ 80°c trong 8h. Phân tích mẫu dung dịch thu được bằng phương pháp HPLC với các điều kiện sắc ký được bố trí như phần 2.2.1.1. Ghi lại sắc ký đồ thu được (hình 6).
Hình 6: sắc ký đồ của mẫu dung dịch phân huỷ.
Nhận xét:
Với sắc ký đồ của mẫu chưa đem phân huỷ, không có pic xuất hiện sau pic captopril. Nhưng trong sắc ký đồ của mẫu dung dịch phân huỷ, có một pic lạ xuất hiện sau pic captopril với thời gian lưu là 8,29 phút. Điều này chứng tỏ captopril đã phân huỷ và sản phẩm phân huỷ của captopril xuất hiện trên sắc ký đồ với thời gian lưu là 8,29 phút, tách hoàn toàn so với pic của captopril ở thời điểm 4,59 phút với độ phân giải là 6,87 > 2.
=> Như vậy, có thể áp dụng điều kiện sắc ký như trên để định lượng và nghiên cứu độ ổn định của captopril.
2.2.2. Xây dựng đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic vàonồng độ captopril nồng độ captopril
Trong phương pháp thử khả năng giải phóng captopril từ các mẫu viên nang có chứa các viên nén mini, môi trường hoà tan là dung dịch acid hydrocloric 0,0 IN và nồng độ captopril giải phóng vào môi trường tại các thời điểm tương đối thấp (< 25 fj,g/ml). Nhằm đánh giá chính xác lượng captopril giải phóng, chúng tôi tiến hành xây dựng đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ Captopril.
Tiến hành:
^ Pha các dung dịch có nồng độ captopril lần lượt là 5; 10; 15; 20; 25 |ig/ml trong dung dịch acid hydrocloric 0,0IN.
Định lượng các mẫu dung dịch bằng phương pháp HPLC, ghi lại diện tích pic đáp ứng của captopril. Mỗi mẫu được định lượng 5 lần.
Kết quả được trình bày trong bảng sau:
Bảng 2: Mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic của captoprỉl.
c (|ig/ml) 5 10 15 20 25
Diện tích trung bình 243704 512816 727933 981263 1224219
SD ±2087 ±8770 ±6553 ±9907 ±9249
RSD (%) 0,856 1,710 0,900 1,010 0,755
Nhận xét:
Đồ thị ở hình 7 cho thấy, trong khoảng nồng độ khảo sát có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic với nồng độ captopril (|j,g/ml) với hệ số tương quan hồi quy R2=0,9992 (« 1). Giá trị RSD nhỏ cho thấy phép định lượng này có độ lặp lại cao.
Do đó, để định lượng captopril giải phóng từ các mẫu viên nang, chúng tôi pha dung dịch chuẩn có nồng độ c « 20 )Lig/ml. Tiến hành sắc ký và tính kết quả bằng phương pháp so sánh diện tích pic captopril của các mẫu thử với diện tích pic captopril của mẫu chuẩn đã biết nồng độ này.
2 1400000 - ã -g 1200000 - a 1000000 - 5 800000 - 600000 - 400000 - 200000 - 0 - 0 5 10 15 20 25 30 Nồng độ (ịig/ml)
Hình 7: Đường chuẩn captopril trong dung dịch HCl 0,01N.
2.2.3. Khảo sát khả năng bị oxy hoá của captopril và tác dụng chống oxyhoá của acid ascorbic và dinatri edetat đối với captopril hoá của acid ascorbic và dinatri edetat đối với captopril
Captopril rất dễ bị oxy hoá trong dung dịch, nhất là ở pH>4. Trong khi đó, captopril được giải phóng và hấp thu chủ yếu ở ruột non có pH«6-7. Thêm vào đó, trong ruột non có rất nhiều ion kim loại xúc tác cho phản ứng oxy hoá captopril. Do đó lượng captopril sau khi giải phóng khỏi viên bị phân huỷ đáng kể, dẫn đến giảm sinh khả dụng của thuốc [13]. Trong khoá luận này, chúng tôi dự kiến đưa hai chất chống oxy hoá là AcA và DNE vào công thức viên nén mini captopril TDKD nhằm mục đích:
AcA có tác dụng chống oxy hoá và tạo vùng pH thấp xung quanh viên giúp ổn định captopril sau khi giải phóng khỏi viên.
^ DNE có tác dụng khoá các ion kim loại xúc tác cho phản ứng oxy hoá của captopril.
Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng bị oxy hoá của captopril và ảnh hưởng của hai chất chống oxy hoá đến độ ổn định của captopril.
Tiến hành pha các mẫu dung dịch có thành phần ở bảng 3 trong môi trường dịch ruột nhân tạo không có pancreatin.
Chia các mẫu dung dịch thành hai nhóm ống nghiệm. Nhóm 1 được giữ
ở nhiệt độ 37°c. Nhóm 2 được giữ ở 60°c.
Bảng 3: Thành phần và nồng độ các mẫu dung dịch.
Mẫu Captopril (mg/ml) AcA (mg/ml) DNE (mg/ml)
1 1 0 0
2 1 5 0
3 1 0 1
4 1 5 1
Tiến hành phân tích các mẫu dung dịch của hai nhóm tại các thời điểm Oh, 2h, 4h, 6h, 24h bằng phương pháp HPLC. Ghi lại các sắc ký đồ.
Định lượng captopril còn lại trong các mẫu dung dịch của hai nhóm ống nghiệm tại các thời điểm. Tính phần trăm captopril còn lại so với thời điểm Oh.
Kết quả được trình bày ở bảng 4, hình 8 và 9.
Bảng 4: Phần trăm captopriỉ còn lại trong các mẫu dung dịch.
Nhiệt độ Mẫu 2h (%) 4h (%) 6h (%) 24h (%) 37°c 1 93,94 93,94 88,89 78,79 2 100,00 99,01 98,02 97,03 3 100,00 99,02 98,02 97,06 4 97,92 97,92 96,87 90,62 60°c 1 88,89 79,80 68,69 46,46 2 100,00 97,03 90,10 90,10 3 100,00 98,04 98,04 98,04 4 97,92 94,77 91,67 89,58
Mẫu
Hình 8: Biểu đồ phần trăm captopril còn lại trong các dung dịch Ở37°c.
Mẫu
Hình 9: Biểu đồ phần trăm Captopril còn lại trong các dung dịch ở 60°c.
Nhận xét:
Từ các sắc ký đồ thu được, nhận thấy: Với mẫu 1 bắt đầu từ 2h, trên sắc đồ đã xuất hiện pic của sản phẩm phân huỷ ở thời điểm 8,28 phút. Pic này thấy rõ ở thời điểm 24h và mẫu đặt ờ60°c. Với c á c mẫu 2, 3, 4 pic này tương đối nhỏ.
Từ bảng 4 và hai biểu đồ hình 8, 9, thấy rằng:
Ở 37°c, m ẫ u k h ô n g c ó c h ấ t c h ố n g o x y h o á t h ì c a p t o p r il p h â n h u ỷ
rất nhanh: 2h đầu phân huỷ 6,06% tăng đến 11,11% ở giờ thứ 6 và sau 24h thì lượng captopril còn lại là 78,29%. Sự có mặt của các chất chống oxy hoá làm giảm đáng kể lượng captopril bị phân huỷ: mẫu 2, 3 ở 2h đầu captopril không phân huỷ, đến 24h lượng captopril còn lại vẫn trên 97%. Các mẫu ở 60°c cho kết quả tương tự.
Tốc độ phân huỷ tăng rõ khi tăng nhiệt độ. Với mẫu 1, ở 37°c, sau 4h phân huỷ 6,06%, sau 24h phân huỷ 1/5 so với lượng ban đầu. Còn ở 60°c,
sau 4h phân huỷ 31,3%, đến 24h thì lượng captopril chỉ còn chưa đến 50%. ^ Sự có mặt của đồng thòi hai chất AcA và DNE có khả năng chống oxy hoá hơi kém hơn so với dùng riêng từng chất. Tuy nhiên trong điều kiện môi trường dịch ruột thực tế, do pH kiềm, sự có mặt của rất nhiều ion kim loại và tác động của rất nhiều yếu tố sinh lý của cơ thể nên sự phối hợp của hai chất này là vẫn cần thiết.
2.2.3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ AcA đến độ phân huỷ của captopril
Các công trình nghiên cứu trước đều cho thấy lượng chất chống oxy hoá tỷ lệ thuận với độ bền vững của dược chất [26]. Nhưng nếu lượng chất chống oxy hoá quá lớn sẽ ảnh hưởng đến tỷ lệ tá dược kéo dài và khối lượng viên, do đó chúng tôi tiến hành khảo sát để chọn lựa lượng tá dược này cho phù hợp.
Tuy nhiên, nếu đưa vào cơ thể lượng DNE quá lớn hoặc sử dụng trong một thời gian dài thì có khả năng DNE tạo phức với calci trong cơ thể gây