L ời cam đoan
2.1.1Địa điểm và thời gian thí nghiệm
Địa điểm thực hiện: thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ thực vật, khoa Nông nghiệp và sinh học ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ.
Thời gian thực hiện: từ tháng 11/2012 đến tháng 06/2013.
2.1.2 Vật liệu thí nghiệm
Vi khuẩn gây bệnh thối gốc thân (Erwinia sp.) được phân lập từ các mẫu lúa bệnh được thu thập từ những ruộng lúa nhiễm bệnh thối gốc thân ở Hậu Giang và An Giang.
Nguồn vi khuẩn đối kháng: 2 nguồn vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens và
Brevibacillus brevis , được cung cấp từ phòng thí nghiệm Phòng trừ sinh học, Bộ
môn Bảo vệ thực vật.
2.1.3 Dụng cụ làm thí nghiệm
Dụng cụ: đĩa Petri, ống nghiệm, micropipette, tủ cấy, máy đo PH, máy lắc, tủ
cấy, kính hiển vi,…
Môi trường nuôi cấy: vi khuẩn (gây bênh và đối kháng)
Môi trường King’B :
Pepton: 20,0g MgSO4.7H2O: 1,5g
K2HPO4: 1,5g
Glycerol: 15ml
Agar: 20g (=0, môi trường lỏng)
Nước cất: 1000ml PH = 7,0
13 Thuốc nhuộm:
+ Dung dịch A:
Tanic acid 2g
AlK(SO4)2 quá bảo hòa nước 10ml Phenol 5% 10ml
+ Dung dịch B:
Crystal Violet 12g Ethanol 95% 100ml
Thuốc Bảo vệ thực vật: Lusatex 5SL, Avalon 8WP, Starner 20WP, Anti_XO 200WP, Kasumin 2SL, Stepguard 200TB.
2.2 PHƯƠNG PHÁP
Mục đích thí nghiệm: Chọn được loại nông dược và vi khuẩn vùng rễ có hiệu quả đối kháng cao với vi khuẩn gây bệnh thối gốc thân lúa.
Phân lập và xác định nguồn bệnh:
- Phân lập: cắt đoạn thân lúa bệnh thành từng đoạn ngắn từ 4-5 cm (có phần mô bệnh và mô khỏe), xử lý bề mặt lá bằng cồn 700 , rửa lại với nước cất vô trùng,
ủ trên giấy thấm vô trùng trong đĩa petri, để trong tủ định ôn 300C. Theo dõi mẫu bệnh ủ thấy những giọt vi khuẩn xuất hiện ứa ra hai đầu đoạn thân lúa thì tiến hành cấy trên môi trường King’s B, sau thời gian 48 giờ, quan sát và tách ròng trên môi
trường King’s B.
- Xác định vi khuẩn Erwinia sp. dựa trên kết quả nhuộm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phương pháp nhuộm roi (Ryu, 1937)
Thuốc nhuộm: + Dung dịch A:
Tanic acid 2g
AlK(SO4)2 quá bảo hòa nước 10ml Phenol 5% 10ml
14 + Dung dịch B:
Crystal Violet 12g Ethanol 95% 100ml
Cách thực hiện: Vi khuẩn được vạch trên môi trường King’B đặc (không chứa carbohydrate) trong 18 giờ. Dùng kim cấy, vít vi khuẩn chuyển sang giọt nước vô trùng trên lame sạch. Để giọt nước khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Nhỏ hỗn hợp thuốc nhuộm lên trong 5 phút. Rửa vùng nhuộm dưới dòng nước chảy trong 2-3
phút, để khô tự nhiên. Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính có độ phóng đại X100. Từ kết quả quan sát số roi của vi khuẩn xác định vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh.
2.2.1 Hiệu quả ức chế đối với dòng vi khuẩn Erwinia sp. -1 gây bệnh thối gốc thân lúa của một số nông dược và vi khuẩn vùng rễ thân lúa của một số nông dược và vi khuẩn vùng rễ
* Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành trong đĩa petri, bố trí hoàn toàn ngẩu nhiên, 19 nghiệm thức (9 loại thuốc x 2 nồng độ thuốc và đối chứng), 5 lặp lại (1 đĩa petri)
=95 dĩa petri
Bảng 2.2.1 Các nghiệm thức trong thí nghiệm
Nồng độ(%) TT Nghiệm thức Thành phần 1(x1) Khuyến cáo 2(x2) Gấp đôi khuyến cáo 1 Lusatex 5SL Ningnanmycin 0,01 0,02 2 Avalon 8WP Oxytetracycline+Gentamyc in sulphate 0,016 0,032
3 Starner 20WP Oxolinic acid 0,01 0,02
4 Anti_XO 200WP
Bismerthiazol 0,03 0,05
5 Agofast 80WP Fosetyl aluminium 0,025 0,05
6 Kasumin 2SL Kasugamycin 0,025 0,05
7 Stepguard 200TB
Streptomycin sulphate 0,01 0,02
8 Baci-1 Bacillus amyloliquefaciens 106 108
9 Brevi-1 Brevibacillus brevis 106 108
15
* Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị vi khuẩn gây bệnh: nhân nuôi vi khuẩn gây bệnh trong ống nghiệm chứa môi trường King’s B lỏng, lắc trên máy lắc ngang 36 giờ. Bình tam giác chứa
môi trường King’s B sau khi thanh trùng, giữ trong water bath, cho vi khuẩn gây bệnh vào môi trường bình tam giác đã ổn định nhiệt độở 50 – 540C, sao cho mật số
vi khuẩn đạt 108 cfu/ml, Chiết môi trường (10 ml) nầy vào đĩa petri.
Đặt khoanh giấy thấm thanh trùng có tẩm thuốc hoặc vi khuẩn đối kháng của 4 nghiệm thức (ứng với 2 nồng độ của 2 loại thuốc hoặc 2 mật số của 2 loại vi khuẩn
đối kháng) xếp cách đều chung quanh cách đối chứng 2,5 cm trên môi trường. Các (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
đĩa được đặt trong tủ định ôn với nhiệt độ 300C.
* Ghi nhận chỉ tiêu
Đo bán kính vành khăn của vi khuẩn gây bệnh bịức chế(cm) theo hai đường thẳng vuông gốc tại tâm vào các thời điểm 12, 24, 48, 72 giờ sau khi thí nghiệm.
2.2.2Hiệu quả ức chế đối với dòng vi khuẩn Erwinia sp. -2 gây bệnh thối gốc thân lúa của một số nông dược và vi khuẩn vùng rễ thân lúa của một số nông dược và vi khuẩn vùng rễ
* Tiến hành thí nghiệm:
(Tương tự thí nghiệm 1).
2.2.3 Hiệu quả ức chế đối với dòng vi khuẩn Erwinia sp. -3 gây bệnh thối gốc thân lúa của một số nông dược và vi khuẩn vùng rễ thân lúa của một số nông dược và vi khuẩn vùng rễ
* Tiến hành thí nghiệm
(Tương tự thí nghiệm 1).
2.3 XỬ LÝ SỐ LIỆU
Số liệu sau khi ghi nhận được xử lý bằng phần mềm Microsoft Office Excel và kiểm định khác biệt bằng phương pháp DUNCAN’S với phần mềm MSTATC
16
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Phân lập vi khuẩn Erwinia sp. từ mẫu lúa nhiễm bệnh thối thân từ An Giang và Cần Thơ Giang và Cần Thơ
Kết quả phân lập từ 2 mẫu lúa bệnh thu thập từ An Giang và Hậu Giang được 3 dòng vi khuẩn từ các mẫu thối thân được phân lập. Các mẫu phân lập đều cho khuẩn lạc của mẫu vi khuẩn trên môi trường King’s B có dạng tròn, màu kem sữa,
hơi nhô lên so với bề mặt môi trường nuôi cấy, có đường rìa xung quanh nhẵn, hơi
nhầy.
Kết quả quan sát vi khuẩn từ mẫu nhuộm roi ở vật kính 100X cho thấy có 3 mẫu vi khuẩn xung quanh tế bào vi khuẩn có 3 – 5 roi, đính ở xung quanh tế bào vi khuẩn ở cả hai mẫu vi khuẩn. Tiến hành đặt tên cho 3 mẫu vi khuẩn như sau:
Erwinia sp.-1, được phân lập ở châu thành An Giang Erwinia sp.-2, đươc phân lập ở châu thành An Giang, Erwinia sp.-3 được phân lập từ Vĩnh thạnh, huyện Cờ Đỏ, Tp Cần Thơ. (Hình 3.1, 3.2, 3.3)
17
Hình 3.2 Vi khuẩn Erwinia sp. -2 (nhuộm chiên mao)
Hình 3.3 Vi khuẩn Erwinia sp. -3 (nhuộm chiên mao)
Các đặc điểm được ghi nhận trên phù hợp với các đặc điểm của giống vi khuẩn
Erwinia theo khóa phân loại vi khuẩn của Garrity và ctv., (2004) và cũng được mô
18
3.2 Hiệu quảức chế đối với dòng vi khuẩn Erwinia sp.-1 gây bệnh thối gốc thân lúa của một số nông dược và vi khuẩn vùng rễ
Kết quả trình bày ở (Bảng 3.1) cho thấy:
Các nghiệm thức thử nghiệm với Starner 20WP, Avalon 8WP, Stepguard 200TB và Bacillus amyloliquefaciens đều có hiệu quả ức chế vi khuẩn gây bệnh ở
cả 2 nồng độ, nhìn chung, trừ ở thời điểm 12 và 72 GSTN, hiệu quả ức chế của nồng độ N2 thường cao hơn so với nồng độ N1. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các loại thuốc còn lại hoàn toàn không có hiệu quả qua các thời điểm khảo sát, ngay cảở nồng độ gấp đôi khuyến cáo.
Thuốc Avalon 8WP cho hiệu quảức chế ở nồng độ gấp đôi khuyến cáo mạnh
hơn ở nồng độ khuyến cáo ở 34 thời điểm (12, 24 và 48 GSTN). Ở nồng độ khuyến cáo thì bán kính vành khăn vùng ức chế của nghiệm thức này tăng từ thời điểm 12
GSTN đến thời điểm 48 GSTN và giảm ở thời điểm 72 GSTN. Hiệu quả biểu hiện mạnh ở thời điểm 48 GSTN với bán kính vành khăn vùng ức chế 5,50 mm. Ở nồng
độ gấp đôi khuyến cáo, hiệu quảức chế đối với dòng Erwinia sp.-1cũng tăng đến thời điểm 48 GSTN với bán kính vành khăn vùng ức chế là 6,80 mm.
Hình 3.4 Kết quả in vitro ở thời điểm 48 giờ sau thử nghiệm, cho thấy Starner 20WP, Avalon 8WP và Stepguard có tác động ức chế trực tiếp sự phát triển của vi
khuẩn Erwinia sp. -1 Stepguard-N2 Stepguard-N2 Avalon 8WP-N2 Starner 20WP-N2 Starner 20WP-N2
19
Bảng 3.1 Bán kính vùng vi khuẩn Erwinia sp. - 1 bị ức chế (mm) qua các thời điểm sau khi
thử nghiệm
Bán kính vòng vô khuẩn qua các thời điểm (mm) Nghiệm thức 12h 24h 48h 72h Lusatex 5SL -N1 0,00 d 0,00 f 0,00 e 0,00 d -N2 0,00 d 0,00 f 0,00 e 0,00 d Avalon 8WP -N1 4,93 a 5.15 bcd 5,50 bc 4,30 ab -N2 6,15 a 6,75 a 6,80 a 5,65 a Starner 20WP -N1 5,35 a 4,85 bcd 5,80 b 4,90 bc -N2 5,73 a 5,45 bc 5,75 b 4,70 c Anti_XO 200WP -N1 0,00 d 0,00 f 0,00 e 0,00 d -N2 0,00 d 0,00 f 0,00 e 0,00 d Agofast 80WP -N1 0,00 d 0,00 f 0,00 e 0,00 d -N2 0,00 d 0,00 f 0,00 e 0,00 d Kasumin 2SL -N1 0,00 d 0,00 f 0,00 e 0,00 d -N2 0,00 d 0,00 f 0,00 e 0,00 d Stepguard 200TB -N1 3,73 b 4,70 cd 4,85 d 4,30 ab -N2 5,88 a 5,55 b 5,65 bc 5,20 ab Bacillus -N1 2,23 c 3,70 e 5,15 cd 4,30 ab -N2 3,80 b 4,70 d 5,60 bc 5,70 a Brevibacillus -N1 0,00 d 0,00 f 0,00 e 0,00 d -N2 0,00 d 0,00 f 0,00 e 0,00 d Đối chứng 0,00 d 0,00 f 0,00 e 0,00 d Mức ý nghĩa ** ** ** ** CV (%) 13,41 8,46 5,52 21,10
Ghi chú: Trong cùng một cột các số liệu trung bình được theo sau bởi một hay những chữ cái giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê trong phép thử Duncan,
- ** khác biệt ở mức ý nghĩa 1%,
- N1:Nồng độ thuốc khuyến cáo;N2:nồng độ thuốcgấp đôi khuyến cáo - h: giờ sau thí nghiệm
- Số liệu được chuyển sang căn (x+0,5) khi phân tích thống kê.
Thuốc Starner 20WP, qua 4 thời điểm thí nghiệm có hiệu quả ức chế của 2 nồng độ không khác biệt nhau về mặt thống kê, bán kính vùng vi khuẩn bịức chếở
20
thời điểm 48 GSTN và giảm ở thời điểm 72 GSTN. Tại thời điểm 48 GSTN ở nồng
độ khuyến cáo thì hiệu quả ức chế của nghiệm thức Starner 20WP ở nồng độ
khuyến cáo là mạnh hơn so với các thời điểm khác với bán kính vòng vô khuẩn 5,80 mm và gấp đôi khuyến cáo là 5,75 mm không khác biệt ý nghĩa giữa 2 nồng độ.
Thuốc Stepguard 200TB có hiệu quảức chế ở thời điểm 12, 24 và 36 GSTN của nồng độ N2 cao hơn ở nồng độ N1, khác biệt ý nghĩa thống kê 1%, với bán kính vùng vi khuẩn bị vùng ức chế là 5,65 mm ở nồng độ gấp đôi khuyến cáo và ở nồng
độ khuyến cáo là 4,85 mm. Đến thời điểm 72 GSTN hiệu quả giảm và giửa ở 2 nồng độ không có sự khác biệt ý nghĩa.
Hiệu quảức chế của vi khuẩn B. amyloliquefaciens lên vi khuẩn gây bệnh kéo
dài đến thời điểm 48 GSTN, đến thời điểm 72 GSTN thì diễn biến bán kính vành
khăn vùng ức chế vẫn còn tiếp tục tăng . Ở mật số 108 cfu/cm, bán kính vùng vi khuẩn bịức chế lớn nhất ở thời điểm 48 GSTN là 5,60 mm, sau đó vẫn còn tăng ở
thời điểm 72 GSTN. Qua kết quả thí nghiệm (Bảng 3.1) cũng cho thấy sự khác biệt khả năng ức chế giữa 2 nồng độ trong đó mật số 108 cfu/cm cho hiệu quả ức chế
mạnh hơn so với mật số 106 cfu/cm.
Tóm lại, thí nghiệm hiệu quả ức chế của một số nông dược và vi khuẩn vùng rễ đối với vi khuẩn Erwinia sp.-1 qua các thời điểm cho thấy các nghiệm thức Starner 20WP, Avalon 8WP, Stepguard 200TB và tác nhân phòng trừ sinh học B. amyloliquefaciens đều có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh với các mức độ khác nhau được thể hiện qua bán kính vùng vi khuẩn Erwinia sp.-1 bị ức chế. Tuy nhiên, trong đó Avalon 8WP cho hiệu quả cao nhất với bán kính vùng vi khuẩn bịức chế là 6,80 mm ở thời điểm 48 GSTN.
3.3 Hiệu quảức chế đối với dòng vi khuẩn Erwinia sp.-2 gây bệnh thối gốc thân lúa của một số nông dược và vi khuẩn vùng rễ lúa của một số nông dược và vi khuẩn vùng rễ
Qua kết quả thí nghiệm (Bảng 3.2 và Hình 3.2) cho thấy các nghiệm thức (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Starner 20WP, Avalon 8WP và Stepguard tác động trực tiếp lên vi khuẩn Erwinia
21
Hiệu quả ức chế của Avalon 8WP đối với vi khuẩn Erwinia sp.-2 có khuynh
hướng giảm từ thời điểm 48 GSTN, tuy nhiên đến thời điểm 72 GSTN thì thuốc
không còn hiệu quả ức chế đối với vi khuẩn gây bệnh. Nhìn chung, vi khuẩn gây
bệnh chịu tác động ở nồng độ gấp đôi khuyến cáo mạnh hơn nồng độ khuyến cáo tại
thời điểm 12 , 24 và 48 GSTN và khác biệt ý nghĩa thống kê 1% giữa 2 nồng độ. Trong đó, tại thời điểm 48 GSTN cho hiệu quả mạnh nhất với bán kính vùng vi khuẩn bị ức chếở nồng độ gấp đôi khuyến cáo là 5,13 mm và nồng độ khuyến cáo
là 5,03 mm.
Hình 3.5 Kết quả in vitro ở thời điểm 72 giờ sau thử nghiệm, động ức chế trực
tiếp của Stepguard 200TB lên sự phát triển của vi khuẩn Erwinia sp. -2
Thuốc Stepguard 200TB đối với vi khuẩn gây bệnh Erwinia sp.-2 không có sự
khác biệt giữa 2 nồng độ ở 3 thời điểm 12, 24 và 48 GSTN, ở thời điểm 72GSTN thì có sự khác biệt ý nghĩa 1%. Tương tự như ở nghiệm thức Avalon 8WP, nghiệm thức Stepguard 200TB cho hiệu quả ức chế mạnh nhất tại thời điểm 48GSTN với bán kính vùng vi khuẩn bịức chế 6,0 mm ở nồng độ gấp đôi khuyến cáo, ở nồng độ
khuyến cáo là 5,13 mm, và giảm từ 48 GSTN.
Dòng vi khuẩn Erwinia sp.-2 không chịu tác động ức chế của các loại thuốc Starner 20WP, Lusatex 5SL, Anti XO 200WP, Agofast 80WP và Kasumin 2SL ở cả
2 nồng độ và 2 tác nhân phòng trừ sinh học ở cả 2 mật số.
Stepguard-N2 Stepguard-N2
22
Bảng 3.2 Bán kính vùng vi khuẩn Erwinia sp. - 2 bị ức chế (mm) qua các thời điểm sau khi
thử nghiệm
Bán kính vòng vô khuẩn qua các thời điểm (mm) Nghiệm thức 12h 24h 48h 72h Lusatex 5SL -N1 0,00 d 0,00 c 0,00 d 0,00 c -N2 0,00 d 0,00 c 0,00 d 0,00 c Avalon 8WP -N1 1,31 c 1,22 b 5,03 c 0,00 c -N2 4,53 a 5,03 a 5,13 b 0,00 c Starner 20WP -N1 0,00 d 0,00 c 0,00 d 0,00 c -N2 0,00 d 0,00 c 0,00 d 0,00 c Anti_XO 200WP -N1 0,00 d 0,00 c 0,00 d 0,00 c -N2 0,00 d 0,00 c 0,00 d 0,00 c Agofast 80WP -N1 0,00 d 0,00 c 0,00 d 0,00 c -N2 0,00 d 0,00 c 0,00 d 0,00 c Kasumin 2SL -N1 0,00 d 0,00 c 0,00 d 0,00 c -N2 0,00 d 0,00 c 0,00 d 0,00 c Stepguard -N1 1,84 bc 5,13 a 5,13 a 2,31 b -N2 3,31 ab 4,09 a 6,00 a 3,12 a Bacillus -N1 0,00 d 0,00 c 0,00 d 0,00 c -N2 0,00 d 0,00 c 0,00 d 0,00 c Brevibacillus -N1 0,00 d 0,00 c 0,00 d 0,00 c -N2 0,00 d 0,00 c 0,00 d 0,00 c Đối chứng 0,00 d 0,00 c 0,00 d 0,00 c Mức ý nghĩa ** ** ** ** CV (%) 33,26 26,80 21,14 2,89
Ghi chú: Trong cùng một cột các số liệu trung bình được theo sau bởi một hay những chữ cái giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê trong phép thử Duncan,
- ** khác biệt ở mức ý nghĩa 1%,
- N1:Nồng độ thuốc khuyến cáo;N2:nồng độ thuốcgấp đôi khuyến cáo - h: giờ sau thí nghiệm
23
Kết quảở Bảng 3.2, cũng cho phép nhận xét hiệu quảức chế vi khuẩn Erwinia
sp. – 2 của các loại thuốc theo thời gian như sau: