c. Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài:
2.2.1 Thu và xử lý nguyên liệu
2.2.1.1 Thu nguyên liệu
Mẫu thực vật được dùng trong đề tài là hạt Ô môi được thu hái tại thành phố Cần Thơ.
Thời gian thu: Tháng 5/2014.
GVHD: NGÔ QUỐC LUÂN SVTH: NGUYỄN CÔNG TẠO-19- Mẫu nguyên liệu được tách sạch, sau đó sấy khô ở 50°C , xay thành bột làm nguyên liệu dùng trong đề tài.
Hình 2.1 Hạt Ô môi 2.2.2 Quy trình điều chế cao acetone
GVHD: NGÔ QUỐC LUÂN SVTH: NGUYỄN CÔNG TẠO-20-
Hình 2.2 Sơ đồ điều chế cao acetone từ hạt Ô môi
Bột hạt Ô môi 4kg
- Ngâm dầm với EtOH 96°
- Lọc bỏ bả, cô cạn dưới áp suất thấp
Bã chiết EtOH Cao EtOH
583 g
- Chiết với n-hexane - Cô cạn dưới áp suất thấp
Cao hexane 90 g Phần không tan
trong n-hexane
- Chiết với EtOAc - Cô cạn dưới áp suất thấp Phần không tan trong EtOAc Phần không tan trong acetone Cao acetone 27 g
- Chiết với acetone - Cô cạn dưới áp suất thấp
Cao EtOAc 380 g
GVHD: NGÔ QUỐC LUÂN SVTH: NGUYỄN CÔNG TẠO-21- Đem cao EtOH phân tán trong nước - cồn ấm chiết lần lượt với các dung môi theo thứ tự độ phân cực tăng dần: n-hexane, EtOAc, acetone.
Lọc lấy phần dịch tan sau khi chiết với n-hexane đem cô loại dung môi dưới áp suất kém thu được cao n-hexane có khối lượng 90 g.
Phần không tan trong n-hexane tiếp tục được chiết với EtOAc. Lọc lấy phần dịch tan sau khi chiết, đem cô loại dung môi dưới áp suất kém thu được cao EtOAc có khối lượng 380 g.
Phần không tan trong EtOAc tiếp tục chiết với acetone bão hòa nước. Lọc lấy phần dịch tan sau khi chiết, đem cô loại dung môi dưới áp suất kém thu được cao acetone có khối lượng là 27 g.
2.2.3 Cô lập, tinh chế chất từ cao acetone
27 g cao acetone được trộn với 50 g silica gel, sấy khô tuyệt đối sau đó được nghiền mịn bằng cối sứ, tiếp theo là tiến hành sắc ký cột với hệ dung môi giải ly tăng dần độ phân cực từ EtOAc (E) = 100% đến EtOAc : MeOH (M) = 90 : 10 cho tới MeOH 100%, tách thành các phân đoạn với các vết chất khác nhau.
Các thông số cột:
Đường kính trong của cột: d = 4,6 cm Chiều dài cột: l = 80 cm
Khối lượng silica gel nhồi cột: 300 g Khối lượng cao acetone sử dụng: 27 g Tốc độ dòng: 10 ml/phút
Hứng bằng erlen: 100 ml
Hệ dung môi giải ly EtOAc tỉ lệ 100%
Dung dịch giải ly được chứa trong các lọ có dung tích 100 ml và được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10% trong cồn tuyệt đối và hơ nóng trên bếp điện. Các lọ cho kết quả sắc ký lớp mỏng giống nhau (về màu và Rf) được gom thành một phân đoạn. Kết quả sắc ký cột được trình bày chi tiết ở Bảng 2.1
GVHD: NGÔ QUỐC LUÂN SVTH: NGUYỄN CÔNG TẠO-22-
Bảng 2.1 Kết quả sắt ký cột cao acetone
Hệ dung môi Số lọ Tách phân
đoạn Kết quả SKLM Khối lượng E : M = 100 : 0 1 - 17 SA01 Nhiều vết mờ 0,47 g
E : M = 90 : 10 18 - 53 SA02 Có vết chính màu vàng 2,67 g E : M = 80 : 20 53 - 89 SA03 Có vết chính màu cam 2,83 g
E : M = 70 : 30 89 - 134 SA04 Vết màu cam kéo dài 3,42 g E : M = 50 : 50 134 - 172 SA05 Nhiều vết, kéo dài 4,96 g E : M = 0 : 100 172 - 204 SA06 Vết kéo dài 10,01 g
Tổng 24,36 g
2.2.4 Cô lập các chất từ phân đoạn SA02
SKLM của phân đoạn SA02 cho thấy có vết chính màu vàng. Tiếp tục tiến hành sắc kí cột trên phân đoạn SA02 với hệ dung môi giải ly tăng dần độ phân cực từ Chloroform 100% đến MeOH 100%.
Thông số cột:
Đường kính trong cột: d = 2,9 cm Chiều dài cột: l = 65 cm
Khối lượng silica gel nhồi cột: 50 g Khối lượng mẫu: 2,67 g
Tốc độ dòng: 5 ml/phút Hứng bằng erlen 50 ml
Hệ dung môi giải ly C : M = (100 : 0 )
Dung dịch giải ly được chứa trong các lọ có dung tích 50 ml và được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10% trong cồn tuyệt đối và hơ nóng trên bếp điện. Các lọ cho kết quả sắc ký lớp mỏng giống nhau (về màu và Rf ) được gom thành một phân đoạn. Kết quả sắc kí cột phân đoạn SA02 được trình bày trong Bảng 2.2
GVHD: NGÔ QUỐC LUÂN SVTH: NGUYỄN CÔNG TẠO-23-
Bảng 2.2 Kết quả sắt ký cột phân đoạn SA02
Hệ dung môi Số lọ Tách phân
đoạn Kết quả SKLM Khối lượng C : M = 100 : 0 1 - 6 SA021 Nhiều vết mờ 0,051 g
C : M = 90 : 10 7 - 21 SA022 Vết chính màu vàng 0,521 g
C : M = 80 : 20 22 - 35 SA023 Vết màu vàng, kéo dài 0,318 g C : M = 70 : 30 35 - 47 SA024 Nhiều vết, kéo dài 0,285 g C : M = 50 : 50 47 - 56 SA025 Nhiều vết mờ 0,237 g C : M = 0 : 100 57 - 64 SA026 Vết mờ, kéo dài 0,735 g
Tổng 2,147 g
Sau khi cô loại dung môi, ở phân đoạn SA022, từ lọ 7 - 21, xuất hiện kết tinh màu vàng , tiến hành rút dung dịch riêng và rửa kết tinh nhiều lần trong MeOH, thu được chất kết tinh màu vàng . Tiến hành kiểm tra hợp chất thu được sau khi kết tinh lại bằng SKLM, hiện hình bằng dung dịch H2SO4 10% trong cồn tuyệt đối và hơ nóng trên bếp điện. Kết quả thu được là trên bản mỏng chỉ xuất hiện một vết vàng duy nhất đặt tên chất thu được là CGSA01, khối lượng 302,8 mg.
2.2.5 Cô lập các chất từ phân đoạn SA03
SKLM của phân đoạn SA03 cho vết màu cam. Tiến hành sắc ký phân đoạn SA03 với hệ dung môi có độ giải ly tăng dần độ phân cực với tỷ lệ C : M = 90 : 10.
Thông số cột:
Đường kính trong cột: d = 2,9 cm Chiều dài cột: l = 65 cm
Khối lượng silica gel nhồi cột: 50 g Khối lượng mẫu: 2,83 g
Tốc độ dòng: 5 ml/phút Hứng bằng erlen 50 ml
Hệ dung môi giải ly C : M = 90 : 10
Theo dõi quá trình sắc ký cột bằng sắc ký bảng mỏng (TLC), hiện vết bằng đèn UV và phun xịt dung dịch H2SO4 10% trong cồn tuyệt đối và hơ nóng trên bếp điện.
GVHD: NGÔ QUỐC LUÂN SVTH: NGUYỄN CÔNG TẠO-24- Các lọ cho kết quả sắc ký lớp mỏng giống nhau (về màu và Rf) được gom thành một phân đoạn. Quá trình sắc ký được tiến hành trong Bảng 2.3
Bảng 2.3 Kết quả sắt ký cột phân đoạn SA03
Hệ dung môi Số lọ Tách phân
đoạn Kết quả SKLM Khối lượng
C : M = 95 : 5 1 - 10 SA031 Nhiều vết mờ 0,031 g C : M = 90 : 10 10 - 18 SA032 Nhiều vết mờ 0,101 g
C : M = 80 : 20 18 - 29 SA033 Vết chính màu cam 0,682 g
C : M = 70 : 30 29 - 51 SA034 Nhiều vết, kéo dài 0,427 g C : M = 50 : 50 51 - 60 SA035 Nhiều vết mờ 0,395 g C : M = 0 : 100 60 - 67 SA036 Nhiều vết, kéo dài 0,746 g
Tổng 2,382 g
Phân đoạn SA033 đem kết tinh nhiều lần với hệ dung môi C : M = 90 : 10 rữa bằng dung dịch thích hợp thu được chất kết tinh hình kim màu trắng có khối lượng
218,2 mg, kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng (TLC), hiện hình bằng dung dịch H2SO4
10% trong cồn tuyệt đối và hơ nóng trên bếp điện. Kết quả thu được là trên bản mỏng chỉ xuất hiện một vết tròn màu cam duy nhất đặt tên chất thu được là CGSA02.
GVHD: NGÔ QUỐC LUÂN SVTH: NGUYỄN CÔNG TẠO-25-
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1 NHẬN DANH CẤU TRÚC HỢP CHẤT
3.1.1 Xác định tính chất vật lý, cấu trúc và nhận danh hợp chất CGSA01
Hợp chất CGSA01 là chất kết tinh hình kim, màu vàng, tan tốt trong dung môi DMSO, SKLM giải ly bằng hệ dung môi C : M = 80 : 20, hiện vết bằng dung dịch H2SO4 10% trong cồn tuyệt đối và hơ nóng bằng bếp điện cho vết màu vàng, Rf = 0,53
Hình 3.1 Tinh thể bám trên ống nghiệm và kết quả SKLM hợp chất CGSA01
Phổ 1H-NMR (DMSO, 500 MHz, δH ppm, J Hz) cho các tín hiệu của năm proton vòng thơm, trong đó:
Hai proton vòng thơm δH 7,35 (1H, dd, J = 1 Hz và 8 Hz); δH 7,65 (1H, dd,
J = 1 Hz và 7,5 Hz) chứng tỏ hai proton này vừa ghép cặp ortho và meta với proton khác trên cùng một nhân thơm.
Một mũi ba δH 7,74 (1H, t,) chứng tỏ proton này ghép cặp ortho với hai proton khác trên cùng một nhân thơm.
Hai tín hiệu mũi đơn δH = 7,54 (1H, s); δH = 7,71 (1H, s). Một mũi proton kiềm nối δH = 12,9 (1H, s).
Tín hiệu proton của nhóm methyl δH = 2,47 (3H, s). Các tín hiệu proton của phân tử đường glucose.
Phổ 13C-NMR (DMSO, 125 MHz, δH ppm) kết hợp với kỹ thuật DEPT cho 21
tín hiệu của 21 carbon gồm:
GVHD: NGÔ QUỐC LUÂN SVTH: NGUYỄN CÔNG TẠO-26- Hai carbon cacbonyl δC 182,1; 187,7.
Năm carbon tứ cấp δC 116,8; 132,5; 118,3; 134,5; 147,4 và năm carbon tam cấp δC 124,3; 136,2; 118,3; 121,3; 122,8.
Một carbon methyl δC 21,8.
Sáu carbon của phân tử đường glucose trong đó có δC 100,5 (C-anomer)
Phổ MS cho peak ion phân tử giả M + 23 = 439 vậy M = 416 đvC phù hợp với CTPT: C21H20O9
Từ dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR cho phép dự đoán cấu trúc của CGSA01 là một anthraquinone mang đường glucose.
Hình 3.2 Khung anthraquinone được đề nghị cho hợp chất CGSA01
Hình 3.3 Phần đường glucose của CGSA01
Phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu của một nhóm hydroxy kiềm nối chứng tỏ
nhóm hydroxy này phải gắn C-8. Phổ HMBC xuất hiện tín hiệu tương quan của
proton kiềm nối δH (12,9,s) với một carbon tứ cấp mang oxygen δC 161,4; một carbon tứ cấp δC 116,8; một carbon tam cấp δC 124,3; ba carbon trên lần lược là C-8; C-8a; C-7. Kết hợp với phổ HSQC, xác định được δH 7,35 (1H, dd, J = 1 Hz và 8 Hz) là H-7. Do đó, proton ghép cặp meta với H-7 là H-5 có δH 7,65 (1H, dd, J = 1 Hz và 7,5 Hz) và proton ghép ortho với H-7 và H-5 là H-6 có δH 7,74 (1H, t). Dựa vào phổ HSQC ta
GVHD: NGÔ QUỐC LUÂN SVTH: NGUYỄN CÔNG TẠO-27- xác định được C-5 có δC 118,31 và C-6 có δC 136,2. Trên phổ HMBC, còn cho thấy proton H-6 δH 7,74 (1H, t) còn tương quan với carbon bậc bốn δC 132,5 là C-5a.
Trên phổ HMBC, cho thấy proton H-5 δH 7,65 (1H, d, J = 7,5 Hz) có tương quan với carbon carbonyl δC 182,1 vậy δC 182,1 là C-10. Vậy carbon carbonyl δC 187,7 là C-9.
Mặc khác, phổ HMBC cho thấy hai proton δH = 7,54 (1H, s) và δH = 7,71 (1H, s) thuộc cùng một vòng thơm. Carbon C-10 δC 182,1 có tương quan với proton δH 7,71 (1H, s) vậy proton δH 7,71 (1H, s) là H-4, kết hợp với phổ HSQC xác định được δC 121,3 là C-4. Phổ HMBC cho tín hiệu tương quan của proton H-4 δH 7,71 (1H, s) với carbon tam cấp δC 122,8 và dựa vào phổ HSQC ta xác định được proton tương quan với carbon tam cấp δC 122,8 là proton δH = 7,54 (1H, s). Vậy carbon tam cấp δC 122,8 là C-2 và proton δH = 7,54 (1H, s) là H-2. Bên cạnh đó, phổ HMBC cho thấy sự tương quan proton của nhóm methyl δH= 2,47 (3H, s) với C-2 δC 122,8; C-4 δC 121,3 và carbon tứ cấp δC 147,4 kết hợp với phổ HSQC ta xác định được carbon methyl là δC 21,8 và phải gắn vào C-3 carbon tứ cấp có δC 147,4. Proton H-2 δH 7,54 (1H, s) tương quan với carbon tứ cấp mang nối đôi (C=C) liên kết với oxygen δC 154,8 nó là C-1. Phổ HMBC, cho thấy thêm tương quan giữa proton H-2 δH 7,54 (1H, s) và proton H-4 δH 7,71 (1H, s) với carbon tứ cấp δC 118,34, vậy carbon tứ cấp δC 118,34 là C-1a và carbon tứ cấp δC 134,5 phải là C-4a.
Phổ HSQC và HMBC xác định δC 100,5 là C-1″ là carbon anomer và proton δH 5,16 (1H,d) cùng tương quan với carbon δC = 158,4 (C-1) và gắn trên carbon δC 100,5 (C-1″) là proton annomer H-1″, hằng số ghép J = 7,5 Hz chứng tỏ phần đường β- glucose này tạo liên kết với khung anthraquinone tại C-1. Ngoài ra, còn các tín hiệu proton δH 4,63 (1H, t, J = 5,5 Hz); δH 3,33 (1H, m); δH 3,24 (1H, m); δH 3,72 (1H, m); δH 5,1 (1H, dd, J = 15,25 Hz) gắn với các carbon tương ứng là δC (73,4); δC (76,6); δC (69,6); δC (77,3); δC (60,7). Đây là các tín hiệu của phân tử đường β-glucose.
Dữ liệu phổ NMR của hợp chất CGSA01 sau khi quy nạp, sắp xếp và kiểm tra được trình bày trong Bảng 3.1.
GVHD: NGÔ QUỐC LUÂN SVTH: NGUYỄN CÔNG TẠO-28-
Bảng 3.1 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất CGSA01
Vị trí C/H 1H- NMR (DMSO, 500 MHz, δHppm, J Hz) 13C- NMR (DMSO, 125 ppm, δC ppm) Qui kết loại carbon MHBC 1H → 13C 1 158,4 =CH< 2 7,74 (1H, s) 122,8 =CH- C-1a, C-1, C-3, C-4 3 147,4 =C< 4 7,71 (1H, s) 121,3 =CH- C-1a, C-2, C-10 5 7,65 (1H, dd, 1 Hz; 7,5 Hz) 118,31 =CH- C-7, C-10 6 7,74 (1H, t, 8 Hz) 136,2 =CH- C-5a, C-8 7 7,35 (1H, dd, 1 Hz; 8 Hz); 124,3 =CH- C-5, C-8a, C-8 8 161,4 =C< 9 187,7 >C=O 10 182,1 >C=O 1a 118,34 =C< 4a 134,5 =C< 5a 132,5 =C< 8a 116,8 =C< 3′ 2,47 (3H,s) 21,8 -CH3 C-3″, C-4″ 1″ 5,16 (1H, d, 7,5Hz) 100,5 -CH2-O- 2″ 4,63 (1H, t, 5,5 Hz) 73,4 >CH-OH 3″ 3,33 (1H, m) 76,6 >CH-OH 4″ 3,24 (1H, m) 69,6 >CH-OH 5″ 3,72 (1H, m) 77,3 >CH-O- 6″ δH 5,1 (1H, dd, 15,25 Hz) 60,7 - CH2-OH
Từ các xác nhận phổ nêu trên thì hợp chất CGSA01 được nhận danh là: 1-O-β- D-glucopyranosyl chrysophanol (Pulmatin)
GVHD: NGÔ QUỐC LUÂN SVTH: NGUYỄN CÔNG TẠO-29-
Bảng 3.2 So sánh dữ liệu phổ NMR của CGSA01 với Pulmatin
Vị trí C/H
CGSA01( DMSO) Pulmatin [21,25]
δH (ppm) 500 MHz δC (ppm) 125 MHz δH (ppm) 400 MHz δC (ppm) 100 MHz 1 158,4 158,7 2 7,54 (1H, s) 122,8 7,49 (1H, s) 122,8 3 147,4 148,0 4 7,71 (1H, s) 121,3 7,86 (1H, s) 120,9 5 7,65 (1H, d, 1 Hz; 7,5 Hz) 118,31 7,85 (1H, d, 7,64 Hz) 119,7 6 7,74 (1H, t, 8 Hz) 136,2 7,86 (1H, s); 136,3 7 7,35 (1H, d, 1 Hz; 8 Hz) 124,3 7,70 (1H, dd, 1,9 Hz; 7,5 Hz) 124,4 8 161,4 162,0 9 187,7 187,9 10 182,1 182,5 1a 118,34 119,7 4a 134,5 135,1 5a 132,5 132,5 8a 116,8 115,1 3′ 2,47 (3H,s) 21,8 2,41 (3H,s) 21,8 1″ 5,16 (1H, d, 7,5 Hz) 100,5 5,14 (1H, d, 7,76 Hz) 100,9 2″ 4,63 (1H, t, 5,5 Hz) 73,4 73,6 3″ 3,33 (1H, m) 76,6 3,20 - 3,70 (6H, m) 76,9 4″ 3,24 (1H, m) 69,6 3,20 - 3,70 (6H, m) 69,9 5″ 3,72 (1H, m) 77,3 3,20 - 3,70 (6H, m) 77,6 6″ δH 5,1 (1H, dd, 15,25 Hz) 60,7 7,19 (1H, s), 61,0
GVHD: NGÔ QUỐC LUÂN SVTH: NGUYỄN CÔNG TẠO-30-
Hình 3.4 Cấu trúc hóa học của hợp chất CGSA01
3.1.2 Xác định tính chất vật lý, cấu trúc và nhận danh hợp chất CGSA02
Hợp chất CGSA02 là chất kết tinh trong MeOH ở dạng hình kim màu trắng, tan tốt trong metanol. Sắc ký lớp mỏng với dung dịch giải ly C : M = 75 : 25 và hiện vết bằng dung dịch H2SO4 10% trong cồn tuyệt đối và hơ nóng bằng bếp điện cho vết tròn màu cam Rf = 0,6
Nhiệt độ nóng chảy: 238 - 240°C
Hình 3.5 Tinh thể bám trên ống nghiệm và kết quả SKLM hợp chất CGSA02
Phổ 1H- NMR (DMSO, 500 MHz, δH ppm, J Hz) cho các tính hiệu:
Hai proton vòng thơm δH 5,89 (1H, d, J = 2 Hz); δH 5,72 (1H, d, J = 2,5 Hz) chứng tỏ hai proton này ghép cặp meta với proton khác trên cùng một nhân thơm.
GVHD: NGÔ QUỐC LUÂN SVTH: NGUYỄN CÔNG TẠO-31- Hai tín hiệu proton của nhóm metylen δH 2,69 (1H, dd, J = 4,5 Hz); δH 2,46 (1H, d, J = 3 Hz)
Hai tín hiệu mũi đôi của 4 proton vòng benzen δH 7,22 (2H, d, J = 8,5); δH 6,71 ( 2H, d, J = 8,5 Hz)
Hai tín hiệu proton gắn vào carbon mang oxygen δH 4,01 (1H, m) và δH 4,8 (1H, s).
Phổ 13C-NMR (DMSO, 125 MHz, δH ppm) cho 15 tín hiệu của 15 carbon gồm:
Ba carbon mang nối đôi (C=C) liên kết với oxygen δC 156,6; δC 156,6; δC 156,3.
Ba tín hiệu của carbon tứ cấp δC 130,0; δC 155,8; δC 98,5.
Tín hiệu của hai carbon tương đương δC 128,3 (2C); δC 114,5 (2C). Ba tín hiệu của carbon bậc hai δC 95,18; δC 94,2; δC 78,1.
Một carbon bậc hai liên kết với oxygen δC 64,9. Tín hiệu một carbon nhóm metylen δC 28,2.
Từ dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR cho phép dự đoán cấu trúc của CGSA02 là một flavonoid có khung flavan. So sánh tín hiệu của phổ 1H-NMR và 13C-NMR với
một số phổ của các chất được tinh chiết từ các bộ phận khác của cây Ô môi và các tài liệu đã công bố ta thấy có sự trùng hợp với (-)-epiafzelechin. Các số liệu so sánh của