2. NHỮNG HỢP CHẤT ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ CÂY ĐỦNG ĐỈNH
2.5.1. Định tính sơ bộ thành phần hóa học của hạt trái đủng đỉnh
2.5.1.1. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất alkaloid
Alkaloid là hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có tính base yếu do sự có mặt của nguyên tử nitơ. Alkaloid là hợp chất tự nhiên hiện diện khá nhiều trong các họ thực vật với cấu trúc hoá học và hoạt tính sinh học rất đa dạng. Đa số alkaloid không màu, ở trạng thái kết tinh rắn với điểm nóng chảy xác định hoặc có khoảng nhiệt độ phân huỷ. Một vài ankaloid ở dạng nhựa vô định hình, một vài alkaloid ở dạng lỏng (nicotine, coniline) và một vài ankaloid có màu (berberin màu vàng, betadinine màu đỏ).
Thuốc thử Mayer
Hoà tan 1,36 g HgCl2 trong 60 ml nƣớc cất và hoà tan 5 g KI trong 10 ml nƣớc cất. Trộn hai dung dịch trên và thêm nƣớc cho đủ 100 ml.
Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch axit loãng có chứa alkaloid, nếu alkaloid xuất hiện kết tủa màu trắng hoặc vàng nhạt. Cần lƣu ý vì tủa tạo thành có thể hoà tan trở lại trong lƣợng thừa thuốc thử hoặc hoà tan bởi AcOH, etanol có sẵn trong dung dịch thử.
Thuốc thử Dragendorff
Dung dịch 1: Hoà tan 8,0 g nitrat bismuth Bi(NO3)3.H2O trong 25 ml HNO3 30%.
Dung dịch 2: Hoà tan 28 g KI và một ml HCl 6N trong 5 ml nƣớc cất.
Trộn hai dung dịch lại với nhau, theo cùng một tỉ lệ thể tích, ta đƣợc thuốc thử Dragendorff. Cho 2 ml mẫu thử vào ống nghiệm, rồi nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff và quan sát hiện tƣợng, nếu có alkaloid sẽ xuất hiện kết tủa từ vàng đến đỏ.
Thuốc thử Wagner
Hoà tan 1,27 gam I2 và 2 gam KI trong 20 ml nƣớc cất, thêm nƣớc cho đủ 100 ml ta đƣợc thuốc thử Wagner. Cho vài giọt thuốc thử này vào mẫu thử, nếu có alkaloid thì sẽ xuất hiện kết tủa màu nâu.
20
Luận văn tốt nghiệp
2.5.1.2. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất flavonoid
Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau, quả, hoa… phần lớn các flavonoid có màu vàng; tuy vậy, một số sắc tố có màu xanh, tím, đỏ, không màu cũng đƣợc xếp vào nhóm này. Các flavonoid thƣờng dễ kết tinh và có màu.
Phản ứng với chì acetate
Dung dịch chứa flavonoid tạo kết tủa vàng với dung dịch chì acetate.
Phản ứng với Cyanidin của Wilstatter hay còn gọi là phản ứng shibata
Phản ứng khử bằng bột Mg trong HCl/etanol trên các dẫn xuất flavonoid.
Cách thực hiện nhƣ sau: Chuẩn bị hai ống nghiệm, cho vào mỗi ống 2 ml cao chiết hoà tan trong methanol. Ống 1 làm đối chứng. Với ống số 2: cho thêm 1 ml alcol
tert-butil hoặc isoamyl; 0,5 ml HCl đậm đặc; 3-5 hạt magnesium kim loại. Đun nhẹ trong vài phút, sẽ xuất hiện màu ở lớp alcol phía trên.
Nếu cao chiết có chứa flavon, flavanon, flavonol, flavanonol, xanthon dung dịch trong ống 2 sẽ có màu cam, đỏ hoặc tím. Nếu cao chiết có chứa isoflavon, isoflavanon, auron dung dịch không đổi màu.
Tác dụng với FeCl3
Dung dịch có chứa flavonoid tác dụng với FeCl3 sẽ tạo kết tủa xanh lục đen.
Tác dụng với H2SO4 đậm đặc
Hoà tan hợp chất flavonoid vào H2SO4 đậm đặc: flavon và flavonol cho màu vàng đậm đến màu cam và có phát huỳnh quang đặc biệt. Chacon, auron cho màu đỏ hoặc xanh dƣơng-đỏ, flavanon cho màu từ cam đến đỏ.
2.5.1.3. Khảo sát sự hiện của các hợp chất steroid
Steroid là hợp chất hữu cơ có cấu trúc tổng quát là hệ thống vòng cyclopentanoperhydrophenantren hoặc trong trƣờng hợp hiếm gặp là sự biến đổi của hệ thống vòng nói trên. Steroid là nhóm hợp chất tự nhiên phân bố rộng rãi trong giới động vật và thực vật.
Phản ứng Liebermann-Burchard
Cho vào ống nghiệm 1 ml anhidrid acetic, 1 ml chloroform, làm lạnh ống nghiệm rồi thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc. Cho mẫu thử ở dạng rắn hoặc pha chloroform. Phản ứng dƣơng tính là dung dịch đổi thành màu xanh dƣơng, lục, cam hoặc đỏ; màu này bền không đổi.
Phản ứng Salkowski
Hoà tan mẫu thử trong 1 ml chloroform và nhỏ thêm vào khoảng 1 ml H2SO4 đậm đặc. Phản ứng dƣơng tính là dung dịch đổi màu thành đỏ đậm, xanh, xanh-tím.
2.5.1.4. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất glycoside
Glycosid là hợp chất mà cấu trúc hoá học gồm có hai phần: phần đƣờng và phần không đƣờng thƣờng đƣợc gọi là aglycon. Dƣới tác dụng của enzyme thực vật, dung dịch acid hoặc kiềm, glycosid bị thuỷ phân thành aglycon và phần đƣờng.
Glycosid hiện diện rất nhiều trong họ thực vật và tất cả các bộ phận của cây: lá, vỏ, hạt… Các glycoside thƣờng là chất kết tinh và có vị đắng.
Phản ứng với thuốc thử Tollens: phản ứng của đƣờng khử.
Chuẩn bị thuốc thử Tollens: lấy khoảng 0,5 ml dung dịch AgNO3 10%. Sau đó cho vào khoảng 0,5 ml dung dịch NaOH 10%, thêm từng giọt NH4OH đến khi tan hết kết tủa.
Cách thử: Trong một ống nghiệm chứa mẫu thử, thêm 5 giọt pyridine và 4 giọt thuốc thử Tollens. Phản ứng dƣơng tính nếu xuất hiện bạc bám trên thành ống nghiệm hoặc có tủa màu trắng bạc của bạc kim loại.
Phản ứng với thuốc thử Fehling
Thuốc thử Fehling đƣợc pha chế bằng cách trộn hai thể tích tƣơng đƣơng nhau hai dung dịch sau:
- Dung dịch 1: hoà tan 63,4 gam CuSO4.5H2O tinh khiết trong nƣớc. Acid hoá dung dịch thu đƣợc bằng dung dịch H2SO4 loãng. Thêm nƣớc cất đến 1 lít. Dung dịch thu đƣợc có màu xanh da trời.
22
Luận văn tốt nghiệp - Dung dịch 2: hoà tan 346 gam tartrat kép kali natri (muối Seignette) và 120 gam NaOH trong nƣớc sau đó thêm nƣớc cất đến thể tích 1 lít. Dung dịch này không màu.
- Trộn 2 dung dịch theo tỉ lệ 1:1 ngay trƣớc khi sử dụng. Khi bảo quản lâu phải để riêng hai dung dịch.
Hoà tan mẫu thử vào thuốc thử Fehling và quan sát hiện tƣợng. Nếu thấy có kết tủa đỏ xuất hiện thì có sự có mặt của glycosid.
2.5.1.5. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất saponin
Saponin là một glycosid phân bố khá rộng trong thực vật, có một số tính chất đặc trƣng: khi hoà vào nƣớc sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt. Saponin thƣờng ở dạng vô định hình, có vị đắng, khó tinh chế, có điểm nóng chảy cao.
Xác định sự hiện diện của saponin bằng cách tạo bọt
Lấy khoảng 2 gam bột cây, lắc mạnh với 10 ml nƣớc, dấu hiệu đầu tiên chứng tỏ sự hiện diện của saponin là xuất hiện bọt bền vững.
Nhận xét: xuất hiện bọt bền vững trong 30 phút. Kết luận: Bột nguyên liệu có chứa saponin.
Xác định sơ bộ sự hiện diện của saponin steroid và saponin triterpen
Lấy khoảng 0,5 g bột, thêm vào 5 ml nƣớc cất. Hỗn hợp đƣợc đun nóng trong ống nghiệm đến sôi trên bếp cách thuỷ, làm lạnh và lọc lấy nƣớc. Để xác định sự có mặt của saponin chúng tôi lấy hai ống nghiệm. Trong ống 1, thêm 5 ml dung dịch HCl 0,1N (PH = 1). Ống nghiệm 2, thêm vào 5 ml dung dịch NaOH 0,1N (PH = 13). Trong cả hai ống nghiệm thêm vào 2-3 giọt mẫu thử và lắc thật mạnh trong 1 phút.
Nếu nhƣ trong cả hai ống nghiệm, bọt tạo thành bằng nhau về cả kích thƣớc, số lƣợng và sự bền vững của cột bọt thì nguyên liệu có chứa saponon triterpen. Nếu nhƣ ở PH = 13, bọt nhiều hơn một vài lần về số lƣợng hay sự bền vững thì nguyên liệu có chứa saponin steroid.
Thuốc thử Liebermann-Burchard
Thực hành: Hoà tan mẫu bằng 1 ml anhydric acetic, thêm từ từ 0,3-0,5 ml H2SO4 đậm đặc thấy xuất hiện mặt phân cách giữa 2 dung dịch trong ống nghiệm:
Nếu có màu hồng đến đỏ hoặc tím thì nhận định sơ bộ có saponin triterpen. Nếu có màu xanh lá cây thì nhận định sơ bộ có saponin steroid.
2.5.1.6. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất tannin
Tanin là hợp chất polyphenol phân bố rộng rãi trong thực vật. Các tanin có trọng lƣợng phân tử 500-3000, hoà tan trong nƣớc tạo nên dung dịch nhớt. Tanin có vị chát, tan đƣợc trong nƣớc, kiềm loãng, cồn, glycerin và aceton, hầu nhƣ không tan trong các dung môi hữu cơ.
Thuốc thử Stiasny: Formol 36% 20 ml, HCl đậm đặc 10 ml.
Thực hành: cho vào ống nghiệm 2 ml mẫu thử, thêm 0,5 ml thuốc thử Stiasny, đun nóng. Trầm hiện màu đỏ cho biết sự hiện diện của tannin.
Dung dịch chì acetat bão hoà
Dung dịch có chứa tannin tạo trầm hiện màu vàng với dung dịch chì acetat bão hoà.
Tác dụng với FeCl3
Dung dịch có chứa tannin tác dụng với FeCl3 sẽ tạo kết tủa xanh lục đen.
2.5.1.7. Khảo sát sự hiện diện của coumarine
Coumarine thuộc nhóm các hợp chất phenol nhƣng phần lớn các nhóm OH phenol đƣợc ether hóa bằng nhóm CH3 hay bằng một mạch terpenoid có từ 1-3 đơn vị isoprenoid. Coumarine là những dẫn chất α-pyron có cấu trúc C6-C3. Benzo α-pyron là chất coumarin đơn giản nhất tồn tại trong thực vật đƣợc biết từ năm 1820 trong hạt của cây Dipteryx odorata Willd. thuộc họ Ðậu. Cây này mọc ở Brazil, có trồng ở Venezuela và còn có tên địa phƣơng là "Coumarou", do đó mà có tên coumarine. Coumarine là chất kết tinh không màu, một số lớn dễ thăng hoa có mùi thơm. Ở dạng kết hợp glycosid thì có thể tan trong nƣớc, ở dạng aglycon thì dễ tan
24
Luận văn tốt nghiệp
Phản ứng mở vòng lacton
Cho vào hai ống nghiệm, mỗi ống nhiệm 2 ml dung dịch thử, thêm vào một trong hai ống 0,5 ml dung dịch NaOH 10%. Đun cả hai ống nghiệm trên bếp cách thuỷ đến sôi, lấy ra để nguội, thêm vào mỗi ống 4 ml H2O. Nếu chất lỏng trong ống có kiềm trong hơn ống không kiềm thì có thể xem là dấu hiệu dƣơng tính. Tiếp tục đem acid hoá ống có kiềm với vài giọt HCl đậm đặc, nếu dung dịch đang trong suốt lại xuất hiện vẩn đục hoặc kết tủa thì đó là dấu hiệu dƣơng tính.
Phản ứng diazo hóa
Thuốc thử diazo: hoà tan nóng 0,9 g sulfanilic trong 9 ml acid hydroclorid đậm đặc. Pha loãng với nƣớc đến đủ 100 ml. Lấy 10 ml dung dịch này, ngâm trong nƣớc đá. Thêm vào đó 10 ml dung dịch natri nitrit 4,5% vừa đƣợc làm lạnh bằng cách ngâm trong nƣớc đá. Giữ hỗn hợp 0ºC trong 15 phút. Nếu dung dịch trong ống chuyển sang màu đỏ thẫm là dƣơng tính.
Kết quả khảo sát thành phân hóa học có trong hạt trái đủng đỉnh
Qua khảo sát sơ bộ các hợp chất có trong hạt trái đủng đỉnh, kết quả định tính đƣợc cho trong bảng 3.
Bảng 3. Kết quả định tịnh sơ bộ thành phần hoá học trong hạt trái đủng đỉnh.
STT HỢP CHẤT THUỐC THỬ HIỆN TƢỢNG KẾT
LUẬN
1 Alkaloid
Dragendoff Kết tủa vàng cam +
Wagner Kết tủa nâu +
Mayer Kết tủa vàng +
2 Flavonoid
Shibata Dung dịch màu đỏ +
H2SO4 đậm đặc Dung dịch đổi màu +
Pb(CH3COO)2 Kết tủa trắng +
3 Steroid
Liebermann-Buchard Dung dịch màu vàng -
Salkowski Vòng ngăn cách màu nâu
đỏ +
4 Glycoside
Felling Không hiện tƣợng -
Tollens Có lớp bạc +
5 Tanin
FeCl3 Kết tủa xanh lục đen +
Pb(CH3COO)2 Kết tủa trắng +
Stiasny Trầm hiện đỏ +
6 Saponin
Lắc Có bọt bền +
HCl và NaOH
Cột bọt trong NaOH cao hơn nên chứa Sponin steroid
+
7 Courmarine
Phản ứng mở vòng
lacton Dung dịch đục -
Phản ứng điazo hoá Dung dịch màu đỏ +
Ghi chú: - âm tính, + dƣơng tính
Nhƣ vậy, trong hạt trái đủng đỉnh có sự hiện diện của: alkaloid, flavonoid, steroid, tanin, glycoside, courmarine, saponin.
3. QUÁ TRÌNH CÔ LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC HỢP CHẤT TRONG CAO CHLOROFORM CHLOROFORM
3.1. Quá trình kiềm hóa bột cây
Từ nguyên liệu ban đầu là 1,1 kg mẫu khô bột cây, tiến hành kiềm hóa bột cây bằng cách ngâm bột cây với 1,5 lít dung dịch NH3 bão hoà, sau 12 tiếng bột cây chuyển thành dạng sệt.
Sau đó tiến hành sấy bột cây đã ngâm đến khối lƣợng không đổi để loại bỏ dung dịch NH3. Sau khi sấy nhận thấy bột cây bị vón cục, tiến hành xay nhỏ bột cây đã
26
Luận văn tốt nghiệp ngâm. Khối lƣợng bột cây thu đƣợc sau khi kiềm hoá thay đổi không đáng kể so với khối lƣợng nguyên liệu ban đầu.
3.2. Quá trình điều chế cao chloroform
Bột cây sau khi kiềm hóa đƣợc đƣa vào hệ thống soxhlet chiết kiệt với dung môi chloroform.
Sau đó, dịch chiết chloroform đƣợc cô cạn bằng máy cô quay chân không thu đƣợc cao chloroform (9 g).
3.3. Quá trình cô lập và tinh chế chất trong cao chloroform
Cao chloroform thu đƣợc tiến hành sắc ký cột silica gel. Lấy 9 gam cao chloroform trộn với 20 gam silica gel, sấy khô tuyệt đối với các dung môi giải ly tăng dần độ phân cực là: petroleum ether, chloroform, methanol.
Cột sắc ký
Đƣờng kính cột: 5 cm Chiều cao cột: 80 cm
Khối lƣợng silica gel: 30 gam
Dung môi trích từ cột đƣợc hứng bằng erlen có dung tích 250 ml.
Cô cạn dung môi trích từ cột bằng máy cô quay chân không. Quá trình sắc ký cột đƣợc theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) với thuốc thử hiện hình là phosphomolipdic acid.
Kết quả sắc ký cột silica gel đƣợc trình bày tóm tắt trong bảng 4.
Bảng 4. Kết quả sắc ký cột silica gel cao chloroform của hạt trái đủng đỉnh. Phân đoạn Số lọ Hệ dung môi giải ly Kết quả sắc ký lớp mỏng Khối lƣợng (g) PĐ1 1-19 PE 100% Một vệt mờ kéo dài 1,33 PĐ2 20-34 PE:CLF = 9:1 Có nhiều vệt mờ 0,29 PĐ3 35-43 PE:CLF = 8:2 Có nhiều vệt mờ 0,18
PĐ4 44-76 PE:CLF = 7:3 Một vệt dài 0,34 PĐ5 77-94 PE:CLF = 6:4 Có nhiều vệt sát nhau 0,65
PĐ6 95-106 PE:CLF = 5:5 Một vệt màu vàng trên
vệt mờ kéo dài 0,34
PĐ7 107-125 PE:CLF = 4:6 Nhiều vệt mờ 0,41
PĐ8 126-133 PE:CLF = 3:7 Vệt kéo dài 0,26
PĐ9 134-158 PE:CLF = 2:8 Nhiều vệt đậm 0,27 PĐ10 159-188 PE:CLF = 1:9 Nhiều vệt đậm 0,58
PĐ11 189-205 CLF = 100% Vệt dài 0,48
PĐ12 206-237 CLF:MeOH = 9:1 Vệt dài 0,74
PĐ13 238-250 CLF:MeOH = 8:2 Vệt dài 0,46
PĐ14 251-163 CLF:MeOH = 7:3 Nhiều vệt đậm gần nhau 0,43
PĐ15 264-272 CLF:MeOH = 6:4 Vệt dài 0,34 PĐ16 273-278 CLF:MeOH = 5:5 Vệt dài 0,14 PĐ17 279-284 CLF:MeOH = 4:6 Nhiều vệt mờ 0.17 PĐ18 285-289 CLF:MeOH = 3:7 Nhiều vệt đậm 0,03 PĐ19 290-295 CLF:MeOH = 2:8 Nhiều vết 0,05 PĐ20 295-316 MeOH = 100% Nhiều vết 0,42 Tổng cộng 7,91 Hiệu suất = 87,89%
Ở phân đoạn PĐ6 ( hệ dung môi PE:CL = 5:5), sau khi thu hồi dung môi và tiến hành sắc ký lớp mỏng thấy có một vệt mờ kéo dài, trên đó có một vệt vàng to, rõ. Tổng khối lƣợng cao là 0,34 gam. Sau khi khảo sát chọn hệ dung môi, phần chất rắn này đƣợc đem tiến hành sắc ký cột lần 2 với dung môi là PE, CLF, MeOH.
28
Luận văn tốt nghiệp
Hình 5. Cột sắc ký và máy cô quay chân không
Sắc ký cột lần 2
Chiều cao cột: 50 cm. Đƣờng kính cột: 1 cm. Khối lƣợng cao: 0,34 gam. Khối lƣợng silica gel: 10 gam.
Dung môi trích từ cột đƣợc hứng bằng chai thuỷ tinh dung tích 25 ml. Kết quả sắc ký đƣợc trình bày trong bảng dƣới đây.
Bảng 5. Kết quả sắc ký cột lần 2 Phân đoạn Số lọ Hệ dung môi giải ly Kết quả sắc ký lớp mỏng Khối lƣợng (g) LV1 1-10 PE:CLF = 2:8 Một vệt dài 0,053 LV2 11-32 PE:CLF = 1:9 Một vệt tròn trên vệt kéo dài 0,088
LV3 33-50 CLF = 100% Một vệt tròn trên vệt kéo dài 0,051 LV4 51-53 CL:MeOH = 9:1 Một vệt tròn, màu vàng 0,010 54-62 Một vệt hơi tròn, kéo dài ở phần dƣới 0,058 LV5 63-68 CL:MeOH = 2:8 Một vệt mờ 0,009 LV6 69-75 MeOH = 100% Một vệt mờ 0,022 Tổng cộng 0,291 Hiệu suất: 85,6%.
Ở phân đoạn LV4 (lọ 50-53), với hệ dung môi CLF:MeOH = 9:1, sau khi thu hồi dung môi và tiến hành sắc ký lớp mỏng thấy có một vệt tròn, màu vàng, rõ với khối lƣợng 10 mg. Kết luận đây là hợp chất sạch, ký hiệu HC55.