2. NHỮNG HỢP CHẤT ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ CÂY ĐỦNG ĐỈNH
2.4.2. Phƣơng pháp chiết, cô lập các hợp chất2,5,9,7, 10
Phƣơng pháp chiết
Chiết là phƣơng pháp dùng một dung môi (đơn hay hỗn hợp) để tách lấy một chất hay một nhóm các chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu.
Các phƣơng pháp chiết rắn-lỏng, lỏng-lỏng hoặc kết hợp cả 2 phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng.
Mỗi phƣơng pháp có nhiều kỹ thuật chiết khác nhau. Trong đề tài này, phƣơng pháp chiết rắn-lỏng sử dụng kỹ thuật chiết bằng máy soxhlet. Kỹ thuật này tiết kiệm dung môi, tiết kiệm thời gian thực hiện, thao tác thực hiện đơn giản, chiết kiệt hợp chất trong bột cây vì bột cây luôn đƣợc chiết bằng dung môi tinh khiết. Kích thƣớc của bộ
soxhlet làm giới hạn lƣợng bột cây cần chiết và hệ thống của bộ soxhlet làm bằng thuỷ tinh nên dễ vỡ.
Phƣơng pháp phân lập các hợp chất
Phƣơng pháp chung đƣợc áp dụng để phân lập các hợp chất chủ yếu là các phƣơng pháp sắc ký.
Sắc ký là một phƣơng pháp vật lý để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất đó đối với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: một pha động và một pha tĩnh). Sắc ký gồm nhiều phƣơng pháp nhƣ: sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HLPC)… Phƣơng pháp sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng với chất hấp thu là silicagel là hai phƣơng pháp sắc ký đƣợc sử dụng trong đề tài này.
Sắc ký cột hở
Sắc ký cột hở là phƣơng pháp sắc ký mà chất hấp thu đƣợc nhồi trong một cột bằng thuỷ tinh (hoặc bằng kim loại) và đƣợc tiến hành trong điều kiện áp suất khí quyển. Đây là phƣơng pháp phổ biến nhất, chất hấp thu là pha tĩnh bao gồm các loại silicagel pha thƣờng cũng nhƣ pha đảo YMC, ODS, Dianion,…
Độ mịn của chất hấp thu hết sức quan trọng, nó ảnh hƣởng đến khả năng tách chất của chất hấp thu. Độ hạt của chất hấp thu càng nhỏ thì khả năng tách chất càng cao và ngƣợc lại. Tuy nhiên chất hấp thu có độ hạt càng nhỏ thì tốc đọ dòng chảy càng chậm. Trong một số trƣờng hợp, khi lực trọng trƣờng không đủ lớn sẽ gây nên hiện tƣợng tắt cột (dung môi không chảy đƣợc), khi đó ngƣời ta phải sử dụng áp suất để tăng tốc độ dòng chảy, với áp suất trung bình (MPC), áp suất cao (HPLC).
Tỷ lệ đƣờng kính cột (D) so với chiều cao của chất hấp thu (L) rất quan trọng và thể hiện khả năng tách của cột. Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể, thông thƣờng tỷ lệ L/D là 8-10. Trong sắc ký, tỷ lệ giữa quãng đƣờng đi của chất cần tách so với quãng đƣờng đi đƣợc của dung môi gọi là Rf, với mỗi chất khác nhau sẽ có một Rf khác nhau. Chính nhờ sự khác nhau về Rf mà ngƣời ta tách đƣợc từng chất ra khỏi hỗn hợp chất.
16
Luận văn tốt nghiệp động từ 1/5 đến 1/10), nếu tách tinh thì tỷ lệ này cao hơn và tuỳ thuộc vào hệ số tách (tức tuỳ thuộc vào sự khác nhau về Rf của các chất) mà hệ số này giao động trong khoảng 1/20 đến 1/30, thậm chí trong trƣờng hợp các chất khó tách riêng thì tỷ lệ này lên tới 1/100 đến 1/200.
Việc đƣa chất lên cột sắc ký hết sức quan trọng. Tuỳ thuộc vào lƣợng chất và dạng chất mà ngƣời ta có thể đƣa chất lên cột bằng các phƣơng pháp khác nhau. Nếu lƣợng chất nhiều và trong giai đoạn chạy thô, thì phổ biến là ngƣời ta phải tẩm chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn rồi đƣa lên cột. Nếu tách tinh, thì ngƣời ta hay đƣa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột với một lƣợng tối thiểu.
Việc chuẩn bị cột ảnh hƣởng trực tiếp đến hiệu quả tách. Yêu cầu cột không đƣợc có bọt khí bên trong (điều này gây nên hiện tƣợng chảy rối trong cột và giảm hiệu quả tách chất), và cột không đƣợc nứt, gãy.
Tốc độ dòng chảy của dung môi cũng ảnh hƣởng đến hiệu quả tách. Nếu tốc độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Tuy nhiên nếu tốc độ dòng chảy quá thấp sẽ làm kéo dài thời gian tách và ảnh hƣởng đến tiến độ công việc.
Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng, dựa chủ yếu vào hiện tƣợng hấp thu trong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh, là một chất hấp thu trơ. Pha tĩnh này đƣợc tráng thành lớp mỏng, đều, phủ trên một nền phẳng nhƣ tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tâm plastic.
Sắc ký lớp mỏng thƣờng đƣợc sử dụng để kiểm tra và định hƣớng cho sắc ký cột do sắc ký lớp mỏng sử dụng ít chất hấp thu, cần rất ít mẫu phân tích, quá trình triển khai sắc ký nhanh. Ngoài việc sử dụng sắc ký lớp mỏng định hƣớng cho sắc ký cột, ngƣời ta còn sử dụng sắc ký lớp mỏng để điều chế thu chất trực tiếp bằng việc sử dụng bản sắc ký lớp mỏng điều chế (bản đƣợc tráng chất hấp thu dày hơn), có thể đƣa lƣợng chất nhiều hơn lên bản, và sau khi chạy sắc ký, ngƣời ta có thể cạo riêng biệt. Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trƣng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch axit sunfuric 10%.