- Thống kê số liệu lợn sinh sản qua sổ sách của trạ
3.4.3. Phương pháp RT – PCR
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29
Hóa chất cần chuẩn bị: Trizol, Chloroform, Isopropyl alcohol (2 – propanol), Ethanol 75%, RNAse – free water.
Các bước tiến hành:
Bước 1: Lấy 100µl virus PRRS vào ống eppendorf 1.5ml.
Bước 2: Bổ sung 1ml Trizol vào ống trên và lắc đều, giữ 5 phút ở
nhiệt độ phòng.
Bước 3: Bổ sung thêm 0.2ml chloroform vào ống và lắc đều giữ 3 phút ở
nhiệt độ phòng.
Bước 4: Ly tâm dung dịch ở 12.000 vòng trong 15 phút ở 40C.
Bước 5: Chuyển 350µl dịch nổi phía trên sang ống mới và bổ sung 500µl isopropyl alcohol, giữở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
Bước 6: Ly tâm dung dịch ở 12.000 vòng trong 10 phút ở 40C.
Bước 7: Loại bỏ dịch nổi và giữ lại cặn, bổ sung 1ml ethanol 75% lặc đều, ly tâm dung dịch ở 7.500 vòng trong 5 phút ở 40C.
Bước 8: Loại bỏ dịch nổi và giữ lại cặn để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng.
Bước 9: Bổ sung 50µl Rnase – free water, lắc đều và bảo quản RNA.
b. Phương pháp RT – PCR
Các bước tiến hành phản ứng RT – PCR: Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ được hỗn hợp với các thành phần phản ứng được trình bày ở bảng sau:
Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (µl)
2X Reaction Mix 12,5
Mẫu RNA 5,0
Primer Forward 0,5
Primer Reverse 0,5
RT/Platium Taq Mix 0,5
Nước cất 6,0
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30
Các mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR:
Mồi xuôi ATG TTG GGG AAG TGC TTG ACC
Mồi ngược CTA GAG ACG ACC CCA TTG TTC CGC
Các mồi này nhằm khuếch đại đoạn gen của virus PRRS.
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ
1 Tổng hợp cDNA 50 30 phút 1 Duỗi mạch 95 5 phút 2 Duỗi mạch 95 15 giây 35 Gắn mồi 50 30 giây Tổng hợp sợi mới 72 1 phút 3 Hoàn chỉnh 72 5 phút 1 4 Giữ sản phẩm 4 ∞
Sản phẩm của phản ứng RT – PCR sẽđược kiểm tra bằng phương pháp điện di. c. Phương pháp điện di
Bước 1:Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
Dung dịch đệm thường được sử dụng trong điện di agarose và polyacrylamid là TBE hoặc TAE, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng TBE và agarose để tạo bản gel.
Bản gel được chuẩn bị bằng dung dịch đệm TBE 1X hòa tan với 1,2 gram agarose đặt trong lò vi sóng ở 1000C trong 5 phút, đổ vào khuôn có các lược được cài sẵn để tạo bản gel với các giếng tra mẫu cần điện di. Khi bản gel đã đông cứng
đặt bản gel vào bểđiện di và đổ dung dịch đệm TBE ngập bản gel khoảng 3 – 5mm.
Bước 2:Tra mẫu điện di
Thêm 2µl loading dye vào 8µl sản phẩm RT – PCR, trộn đều hỗn dịch bằng pipet và chuyển vào các giếng trong bản thạch. Điện di đồng thời cả thang chuẩn
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 31
DNA (marker), thường sử dụng 4 – 6µl DNA Marker.
Bước 3:Chạy điện di
Nguồn điện trong điện di thường sử dụng ở hiệu điện thế 100V cường độ
100mA, thời gian chạy điện di trong 30 phút.
Bước 4: Nhuộm bản gel và đọc kết quả
Kết thúc điện di, bản gel được lấy ra nhuộm Ethidium bromide hoặc SYBR green trong khoảng 5 đến 7 phút. Sau khi nhuộm bản gel được chuyển vào máy phát tia UV để quan sát kết quảđiện di. Vị trí các đoạn DNA được phát hiện bằng những vệt sáng tương ứng của thuốc nhuộm, chụp ảnh và lưu kết quả.