Trong nuôi trồng thủy sản , tiêu chuẩn ngàng (28TCN – 171-2001) đối với lươ ̣ng amôni (NH3-N) là < 0,4 mg/l, với nitrat (NO3-) là <1 mg/l và với nitrit (NO2) là 0,1 mg/l. Nếu vượt quá ngưỡng này , tôm cá có thể bi ̣ bê ̣nh . Muốn đa ̣t được các chỉ tiêu trên cần phải tiến hành ox y hóa amôni thành nitrit và nitrit thành nitrat nhờ các vi khuẩn tự dưỡng . Phản ứng đầu nhờ vi khuẩn Nitrosomonas, phản ứ ng sau nhờ vi khuẩn Nitrosobacter. Do đó, nhóm vi khuẩn oxy hóa amôni và nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrit tham gia vào quá trình nitrat thực hiện oxy hóa amôni thành nitrat đóng vai trò rất quan trọng trong việc làm giảm hợp chất nitơ gây độc cho tôm cá.
3.1.3.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn nitrat hóa
Chúng tôi tiến hành phân lập vi khuẩn oxy hóa amôni trên môi trường thạch Winogradsky I từ một số mẫu nước khác nhau, sau 6 ngày nuôi trong điều kiện hiếu khí ở 28oC đã thu được 13 chủng (bảng 3.13).
Cũng tương tự, vi khuẩn oxy hóa nitrit hóa được phân lập trên môi trường Winogradsky II, kết quả thu được 10 chủng (bảng 3.14).
Bảng 3.13: Đặc điểm hình thái của các chủng oxy hóa amôni phân lập đƣợc Ký hiệu
chủng Đặc điểm khuẩn lạc
Ký hiệu
chủng Đặc điểm khuẩn lạc NA1 - bé, đỏ nhạt, lồi, bóng,
d=0,5-1mm NA8
- vàng đậm, rất bé, nhẵn bóng, d < 0,5mm
NA2 - vàng nhạt,bóng,
d=1-1,3mm NA9
- trong, có nhân màu đỏ, bóng, d= 0,8-1mm
61
1,5mm
NA4 - màu cam, lồi, bé,
d=0,7mm NA11
- vàng chanh, to, dẹt, d=1,5-2mm
NA5 - bé, trắng, lồi, d=0,5mm NA12 - nâu rìa răng cưa, d= 1-
1,2mm
NA6 - trắng đục, dẹt, d=1-1,2mm NA13 - cam nhạt, dẹt, bóng, to,
d=1,5-1,8mm
NA7 - nâu đỏ, bóng, d=1mm
Bảng 3.14: Đặc điểm hình thái của 10 chủng oxy hóa nitrit phân lập đƣợc Ký hiệu
chủng Đặc điểm khuẩn lạc
Ký hiệu
chủng Đặc điểm khuẩn lạc NT1 - nâu, bóng, d = 0,5-1mm NT6 - nâu nhạt, dẹt, d= 1,5mm
NT2 - vàng chanh, lồi,
d = 0,5-0,8mm NT7
- trắng đục, bề mặt khô, d = 0,3 - 0,5mm
NT3 - hồng, nhẵn bóng, d = 0,5 -
1mm NT8
- trắng đục, dẹt, bóng, d = 0.5mm
NT4 - trắng trong, bé NT9 - màu đỏ, rìa trong, d =
1,5-1,7mm
NT5 - da cam, lồi, d= 0,8 - 1mm NT10 - nâu trong, bé, bóng,
d=0,3 – 0,5 mm
Để xác định khả năng chuyển hóa của các vi khuẩn nitrat hóa phân lập được, chúng tôi tiến hành định lượng nitrit tạo thành dựa trên phương pháp Griss trên môi trường Winogradsky I và hàm lượng nitrat tạo thành theo phương pháp Brucine trên môi trường Winogradsky II sau 7 ngày nuôi lắc. Sinh trưởng của vi khuẩn được xác định thông qua đo mật độ quang học OD. Kết quả được trình bày ở bảng 3.15 và 3.16.
Bảng 3.15: Hàm lƣợng nitrit tạo thành và sự sinh trƣởng của 13 chủng oxy hóa amôni phân lập đƣợc
62 (mg/l) (mg/l) NA1 0,413 1,71 NA8 0,539 2,88 NA2 0,735 3,26 NA9 0,980 4,21 NA3 1,316 5,23 NA10 1,728 6.86 NA4 0,909 4,13 NA11 0,511 2,56 NA5 0,492 1,55 NA12 1,674 6,12 NA6 0,689 2,14 NA13 0,755 3,70 NA7 1,869 7,06
Bảng 3.16: Hàm lƣợng nitrat tạo thành và sự sinh trƣởng của 10 chủng oxy hóa nitrit Chủng OD Hàm lƣợng NO3 - (mg/l) Chủng OD Hàm lƣợng NO3- (mg/l) NT1 1,597 6,05 NT6 1,407 4,16 NT2 1,658 6,88 NT7 1,612 6,57 NT3 0,554 2,97 NT8 1,145 4,07 NT4 1,545 5,12 NT9 0,666 3,56 NT5 1,636 5,75 NT10 0,856 4,32
Trong cùng một điều kiện nuôi cấy như nhau, từ 13 chủng oxy hóa amôni phân lập được chúng tôi đã chọn được chủng NA7 và từ 10 chủng oxy hóa nitrit phân lập được đã chọn được chủng NT2 có khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ cao hơn cũng như sinh trưởng trội hơn các chủng còn lại.
3.1.3.2. Đặc điểm hình thái, sinh hóa của 2 chủng vi khuẩn nitrat hóa lựa chọn
Bảng 3.17: Một số đặc điểm hình thái, sinh hóa của chủng NA7 và NT2 Đặc điểm Chủng NA7 Chủng NT2
Hình dạng khuẩn lạc nâu đỏ, bóng, d=1mm vàng chanh, lồi, d=0,5-0,8mm
63
Hình dạng tế bào Que ngắn Que thẳng
Kích thước tế bào 1,0 x 1,5 µm 0,7 x 2,0 µm
Nhuộm Gram Gram (-) Gram (-)
Khả năng chuyển hóa nitơ Oxy hóa amôni Oxy hóa nitrit
Khả năng chịu muối 4% 4%
Theo khóa phân loại Bergey, chủng vi khuẩn oxy hóa amôni NA7 có đặc điểm đặc trưng của vi khuẩn thuộc chi Nitrosomonas. Còn chủng vi khuẩn oxy hóa nitrit NT2 có đặc điểm đặc trưng của vi khuẩn thuộc chi Nitrobacter.
3.2. Tạo chế phẩm
Sự chuyển hóa vâ ̣t chất trong tự nhiên là hết sức phức ta ̣p . Viê ̣c xử lý nước thải nuôi trồng thủy sản không phải là sử dụng một loài vi sinh vật thuần khiết nào đó mà là cả mô ̣t hỗn hợp nhiều loài , tạo ra sự chuyển hóa hài hòa trong to àn bộ chuỗi vâ ̣n chuyển . Mỗi loài sinh vâ ̣t sẽ thực hiê ̣n mô ̣t hoă ̣c vài mắc xích trong toàn bô ̣ chuỗi chuyển hóa.
Các chủng vi sinh vật được lựa chọn nhằm sản xuất chế phẩm phải có hoạt tính sinh học cao : khả năng phân giả i ma ̣nh các cơ chất , thời gian mo ̣c nhnah , tích ứng rộng ở cá c pH và nhiê ̣t đô ̣ khác nhau , có khả năng kháng các chủng gây bệnh . Các chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh học cao thì khi sử dụng sẽ nhân nhanh sinh khối trong mô ̣t thời gian ngắn, tiết ra mô ̣t lượng lớn enzym phân giải.
Sau khi làm các thí nghiê ̣m phân lâ ̣p và tuyển cho ̣n , chúng tôi quyết định sử dụng 4 chủng vi khuẩn Bacillus TL1, L. plantarum L5, Nitrosomonas sp. NA7 và
Nitrobacter sp. NT2 để tạo chế phẩm xử lý nước nuôi trồng thủy sản bi ̣ ô nhiễm.
3.2.1. Thử tính đối kháng lẫn nhau của các chủng vi khuẩn
Kiểm tra tính đối kháng giữa các chủng vi sinh vâ ̣t đã tuyển cho ̣n để xem trong quá trình sinh trưởng và phát triển chúng có ức chế nhau không là viê ̣c làm rất cần thiết. Bởi vì nếu các chủng vi sinh vâ ̣t không ức chế nhau thì chúng ta mới có thể phối trô ̣n chúng vào chung mô ̣t chế phẩm được.
Các chủng được nuôi lắc trên môi trườn g thích hợp, sau đó thu di ̣ch nuôi có chứa kháng sinh . Thử khả năng đối kháng của các chủng theo phương pháp nhỏ
64
dịch. Kết quả được cho thấy các chủng này không có đối kháng nhau . Đây là cơ sở để có thể đưa các chủng này vào trong cùng một chế phẩm.
Bảng 3.18: Thƣ̉ tính đối kháng lẫn nhau của các chủng vi khuẩn
Chủng Bacillus TL1 L. plantarum L5 Nitrosomonas sp. NA7 Nitrobacter sp. NT2 Bacillus TL1 L. plantarum L5 Nitrosomonas sp. NA7 Nitrobacter sp. NT2
3.2.2. Nghiên cứu các điều kiê ̣n lên men xốp thích hợp
Khi đã có 4 chủng vi khuẩn : Bacillus TL1, L. plantarum L5, Nitrosomonas sp. NA 7 và Nitrobacter sp. NT2 chúng tôi tiến hành sản xuất chế phẩm dạng rắn.
3.2.2.1. Lựa chọn môi trường lên men xốp thích hợp
Có thể nói việc lựa chọn môi trường lên men để sản xuất chế phẩm nào đó có vai trò hết sức quan trọng, bởi lẽ thành phần dinh dưỡng trong môi trường lên men phải phù hợp với sự sinh trưởng, phát triển của từng chủng vi sinh vật, và tạo điều kiện kích thích sự hình thành các hoạt tính sinh học của chúng, đồng thời lại phải đảm bảo yếu tố nguồn nguyên liệu sẵn có, dễ kiếm và rẻ tiền.
Chúng tôi tiến hành nuôi cấy c hủng vi khuẩn Bacillus TL 1 và T. plantarum
L5 trên nguồn cơ chất khác nhau như cám ngô, cám gạo, bô ̣t đâ ̣u tương, trấu với đô ̣ ẩm thích hợp . Sau 4 ngày xác định các hoạt tính enzym bằng phương pháp nhỏ dịch.
Kết quả được thể hiê ̣n trong bảng 3.19 và bảng 3.20. Cả hai chủng vi khuẩn
Bacillus TL1 và L. plantarum L5 đều sinh trưởng và thể hiê ̣n hoa ̣t tính enzym ma ̣nh khi đươ ̣c lên men xốp trên các môi trường như cám ngô , cám gạo, bô ̣t đâ ̣u tương . Đặc biệt, vi khuẩn này cho kết quả cao nhất khi lên men trên môi trường cám : trấu (tỷ lệ 1: 1).
65
Bảng 3.19: Ảnh hƣởng của môi trƣờng lên men xốp lên Bacillus
Nguồn cơ chất Hoạt tính enzym
Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza
Cám ngô 24 16 20 21
Cám gạo 26 17 22 20
Cám ngô + bô ̣t
đâ ̣u tương 22 15 19 20
Cám gạo + bô ̣t
đâ ̣u tương 20 15 20 22
Cám ngô + trấu 24 20 24 22
Cám gạo + trấu 35 30 32 33
Bô ̣t đâ ̣u tương +
trấu 25 18 20 19
Bảng 3.20: Ảnh hƣởng của môi trƣờng lên men xốp lên L. plantarum L5:
Nguồn cơ chất
Hoạt tính kháng khuẩn
Vibrio parahaemolyticus E.coli Salmonella typhi Cám ngô 12 11 6 Cám gạo 14 9 7
Cám ngô + Bô ̣t
đâ ̣u tương 13 10 8
Cám gạo + bô ̣t
đâ ̣u tương 15 12 7
Cám ngô + trấu 14 12 8
Cám gạo + trấu 25 22 12
Bô ̣t đâ ̣u tương +
66
Qua hai bảng kết quả ta thấy, môi trường thích hợp cho viê ̣c lên men xốp các chủng vi sinh vật đó là môi trường cám trấu . Điều này cũng rất phù hợp cho viê ̣c sản xuất chế phẩm, vì đây là những nguyên liệu dễ kiếm, rẻ tiền.
3.2.2.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ cám: trấu lên quá trình lên men xốp
Sau khi đã lựa cho ̣n môi trường lên men xốp thích hợp cho các chủng vi sinh vâ ̣t, chúng tôi tiến hành thí nghiệm xem xét ảnh hưởng của tỉ lệ cám : trấu tới khả năng sinh trưởng và tiết enzym của các vi khuẩn.
Chúng tôi tiến hành lên men xốp các vi sinh vật trên các môi trường có tỉ lệ cám: trấu khác nhau (trong đó tỷ lê ̣ cám + trấu/ nước = 1/1). Sau bốn ngày xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp nhỏ dịch , xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp đu ̣c lỗ tha ̣ch. Kết quả được trình bày như hai bảng dưới đây.
Qua hai bảng kết quả ta thấy , chủng Bacillus TL1 sinh trưởng và thể hiê ̣n hoạt tính enzym mạnh nhất ở môi trường có tỷ lệ cám : trấu là 1:1. Tương tự, vi khuẩn L. plantarum L5 cũng cho kết quả cao nhất khi lên men trên môi trường có cám: trấu là 1:1.
Bảng 3.21: Ảnh hƣởng của tỉ lệ cám: trấu lên Bacillus TL1
Tỉ lệ cám: trấu
Hoạt tính enzym
Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza
2: 8 10 9 11 8 3: 7 11 9 12 10 4: 6 15 12 13 11 5: 5 32 30 29 31 6: 4 19 20 17 18 7: 3 15 12 14 13 8: 2 14 13 16 10
67
Bảng 3.22: Ảnh hƣởng của tỉ lệ cám: trấu lên L. plantarum L5
Tỉ lệ cám: trấu
Hoạt tính kháng khuẩn
Vibrio parahaemolyticus E.coli Salmonella typhi 2: 8 - - - 3: 7 9 8 6 4: 6 14 11 8 5: 5 23 21 10 6: 4 14 13 9 7: 3 12 11 7 8: 2 10 10 7
3.2.2.3. Ảnh hưởng của thời gian lên quá trình lên men xốp
Chúng tôi tiến hành lên men xốp các chủng vi sinh vật trên môi trường cám : trấu tỉ lê ̣ 1: 1. Sau 1, 2, 4, 5, 7, 9 ngày lấy thử hoạt tính enzym , kháng khuẩn. Kết quả như sau:
Bảng 3.23: Ảnh hƣởng của thời gian lên men xốp lên Bacillus TL1
Thời gian (ngày)
Hoạt tính enzym
Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza
1 8 9 10 8 2 12 10 11 13 4 29 32 27 32 5 20 23 25 17 7 19 20 17 16 9 13 12 11 12
Bảng 3.24: Ảnh hƣởng của thời gian lên men xốp lên L. plantarum L5
68 Vibrio parahaemolyticus E.coli Salmonella typhi 1 - - - 2 - - - 4 13 11 8 5 24 20 11 7 16 14 9 9 13 11 8
Như vâ ̣y qua hai bảng kết quả ta thấy , chủng Bacillus TL1 sinh enzym ma ̣nh nhất sau 4 ngày lên men xốp . Còn chủng L. plantarum L5 thể hiê ̣n hoa ̣t tính kháng khuẩn ma ̣nh nhất sau 5 ngày lên men.
3.2.2.4. Ảnh hưởng của các nhiệt độ khác nhau
Nhiệt độ là một trong những yếu tố môi trường có ảnh hưởng lớn tới sự sinh trưởng và phát triển của chủng trong quá trình nuôi cấy cũng như trong thực tiễn. Ở điều kiện nuôi cấy trong phòng thí nghiệm, mỗi chủng nuôi cấy thường có một giá trị nhiê ̣t đô ̣ xác định là thích hợp nhất cho quá trình sinh trưởng và phát triển.
Tiến hành lên men xốp các chủng vi sinh vật trong các điều kiện thích
hơ ̣p ở các nhiê ̣t đô ̣ khác nhau . Sau 4 ngày (với vi khuẩn Bacillus TL1) và 5 ngày (với vi khuẩn L. plantarum L5) đem thử các chỉ số sinh ho ̣c .
Bảng 3.25: Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên Bacillus TL1
Nhiê ̣t đô ̣ (oC)
Hoạt tính enzym
Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza
20 9 8 11 9
25 20 19 18 21
30 31 33 30 31
35 20 22 24 18
69
45 15 16 13 14
50 13 12 11 12
Bảng 3.26: Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên L. plantarum L5
Nhiê ̣t đô ̣ (oC)
Hoạt tính kháng khuẩn
Vibrio parahaemolyticus E.coli Salmonella typhi 20 10 8 7 25 12 9 10 30 15 13 9 35 25 21 12 40 17 16 9 45 12 10 8
Qua kết quả ở bảng ta thấy chủng vi khuẩn Bacillus TL 1 thích hợp nhất khi lên men ở 30oC, còn chủng L. plantarum L5 thích hợp nhất khi lên men ở 35oC.
3.2.2.5. Ảnh hưởng của độ ẩm
Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên cơ chất thích hợp có độ ẩm khác nhau. Nuôi trong tủ ấm 4 ngày ở 300C với Bacillus TL1 và 5 ngày ở 35oC với L. plantarum L5. Sau đó đem xác đi ̣nh các hoa ̣t tính enzym, kháng khuẩn.
Kết quả cho thấy cả hai chủng đều sinh trưởng và sinh enzym tốt nhất khi đô ̣ ẩm môi trường lên men xốp là nước : cám trấ u bằng 1:1. Khi có quá ít hoă ̣c quá nhiều nước đều khiến cho sự sinh trưởng bi ̣ giảm sút , đă ̣c biê ̣t với chủng L. plantarum L5 khi có quá ít nước thì không thể hiê ̣n khả năng kháng khuẩn.
Kết quả được thể hiê ̣n chi tiết hơn trong các bảng dưới đây.
Bảng 3.27: Ảnh hƣởng của đô ̣ ẩm lên Bacillus TL1
Độ ẩm (tỷ lê ̣ nước: cám trấu)
Hoạt tính enzym
Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza
70 3: 7 19 20 19 21 4: 6 21 22 25 20 5: 5 30 31 33 32 6: 4 19 21 22 17 7: 3 15 17 12 15 8: 2 12 12 11 13
Bảng 3.28: Ảnh hƣởng của độ ẩm lên L. plantarum L5
Độ ẩm (tỷ lệ nước: cám trấu)
Hoạt tính kháng khuẩn
Vibrio parahaemolyticus E.coli Salmonella typhi 2: 8 - - - 3: 7 10 - 8 4: 6 12 11 9 5: 5 23 20 11 6: 4 16 17 9 7: 3 12 10 7 8: 2 - 8 - 3.2.3. Sản xuất chế phẩm
Tiến hành nhân giống cấp 1, cấp 2 đối với 4 chủng vi sinh vật đã được tuyển chọn làm giống sản xuất chế phẩm vi sinh vật như sau:
Vi khuẩn Bacillus: lựa cho ̣n những ống giống thuần nhất rồi nhân sinh khối riêng rẽ trong môi trường giá đỗ di ̣ch thể trên máy lắc với tốc đô ̣ 180 vòng/ phút trong 24 giờ. Tiếp đến đem giống cấp 1 nhân tiếp trong môi trường giá đỗ di ̣ch thể trên máy lắ c 180 vòng/ phút trong 48 giờ. Sau đó cấy vào môi trường cám trấu ủ ở nhiê ̣t đô ̣ thích hợp. Sau 4 ngày đem sấy khô ở nhiệt độ 40oC.
71
Vi khuẩn lactic đươ ̣c nuôi cấy trên môi trường MRS da ̣ng di ̣ch trong 2 ngày, sau đó được cấy vào m ôi trường cám trấu ở nhiê ̣t đô ̣ thích hợp . Sau 5 ngày đem sấy khô ở 40oC.
Hai chủng nitrat cũng được nuôi cấy trên Winogradsky I và wi nogradsky II và cấy vào môi trường cám trấu như trên .
Bốn chủng trên dược trô ̣n lẫn với nhau the o tỷ lê ̣ 1: 1: 1: 1 tạo thành một chế phẩm vi sinh vâ ̣t.
Thu hồi sản phẩm sau lên men
Sản phẩm sau lên men được đem đi sấy khô ở nhiệt độ 40oC cho đến khi độ ẩm khô đến 10%. Sau đó được phối trộn theo tỉ lệ: 1:1.
Sản phẩm sau khi được phối trộn sẽ được nghiền dưới dạng bột, sau đó được đóng gói trong túi polyme 2 lớp khối lượng 250g và để ở nhiê ̣t đô ̣ phòng . Cứ sau 1