Thí nghiệm sử dụng chế phẩm để làm sạch n ước nuôi trồng thủy sản bị ô nhiễm đươ ̣c tiến hành trong 4 bình dung tích 1000ml. Cho vào mỗi bình 500ml nước lấy từ đầm nuôi tháng thứ 3.
Bình 1 – đối chứng; bình 2, 3, 4 – mỗi bình bổ sung 0,5 g chế phẩm/ lít (0,5 ‰) Bình đố i chứng không có chế phẩm . Tiến hành thí nghiê ̣m trong 10 ngày. Lấy mẫu nước ở các khoảng thời gian 1 ngày, sau 3 ngày, sau 7 ngày và sau 10 ngày để phân tích các chỉ tiêu thủy lí , thủy hóa.
45
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tuyển cho ̣n các chủng vi sinh vâ ̣t
3.1.1. Bacillus
3.1.1.1. Phân lập và tuyển chọn
Một trong những nguyên nhân chính làm ô nhiễm môi trường đầm nuôi đó chính là thành phần các chất hữu cơ dư thừa trong đầm. Thành phần các chất hữu cơ này rất đa dạng chứa hàm lượng protein, tinh bột, kitin, xenlulozơ khá cao. Ngoài ra, trong đầm nuôi cũng tồn tại nhiều loài VSV gây bệnh cho tôm cá. Cho nên, bước đầu chúng tôi tuyển chọn vi khuẩn dựa trên 2 tiêu chí là chọn ra chủng có hoạt tính enzym phân giải cơ chất cao và kháng được với nhiều vi sinh vật kiểm định.
Từ các mẫu đất và nước thu thập tại địa bàn Hà Nội, chúng tôi đã tiến hành phân lập được 31 chủng vi khuẩn Bacillus trên môi trường thạch thường theo phương pháp 2.2.1. Qua sơ tuyển bằng phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch chúng tôi đã chọn ra được 5 chủng có khả năng sinh enzym ngoại bào cao phân giải được cả 4 loại cơ chất là kitin, cazein, CMC, tinh bột. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Hoạt tính enzym của 5 chủng lựa chọn Kí hiệu chủng Hoạt tính enzym (D-d,mm)
Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza
TL1 35 26 32 30
BD2 23 19 23 21
A4 25 20 22 24
D3 20 22 21 20
A2 26 20 23 23
Từ kết quả bảng 3.1 ta thấy chủng TL1 có khả năng sinh enzym phân giải các cơ chất mạnh nhất trong các chủng phân lập được, đặc biệt là có hoạt tính kitinaza rất mạnh (35 mm). Điều này rất cần thiết cho viê ̣c phân giải các chất hữu cơ không mong muốn trong môi trường nuôi trồng thủy sản . Kitinaza phân hủy vỏ tôm lô ̣t xác , proteaza phân hủy thức ăn thừa và xác đô ̣ng vâ ̣t thủy sinh , xenlulaza phân hủy xác tảo . Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn chủng vi khuẩn TL1 cho các nghiên cứu tiếp theo.
46
3.1.1.2. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp lên khả năng sinh trưởng và hoạt tính enzym của chủng vi Bacillus TL1
Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp
Trong quá trình lên men khi tìm được chủng có hoạt tính cao, cần thiết phải lựa chọn môi trường lên men thích hợp nhất để phát huy năng suất tổng hợp các sản phẩm mong muốn. Môi trường được coi là thích hợp là môi trường vừa đảm bảo chủng sản xuất có khả năng sinh trưởng tốt, vừa sản xuất sản phẩm mong muốn với hiệu quả cao nhất.
Tiến hành nuôi cấy lắc chủng TL1 trên 5 loại môi trường khác nhau: LB, ISP-4, NA, Gause I, Gause II ở 28-30oC, pH trung tính. Hoạt tính enzym, pH sau nuôi cấy và khả năng sinh trưởng của vi khuẩn được xác định sau 48h.
Bảng 3.2: Hoạt tính phân giải cơ chất của chủng TL1 trên 5 loại môi trƣờng Môi
trƣờng pH sau OD
Hoạt tính enzym (D-d,mm)
Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza
NA 7,2 0,881 26 23 25 19
LB 8,5 1,667 37 24 33 30
ISP4 7,7 0,671 20 16 21 28
Gause I 7,5 0,276 15 13 18 22
Gause II 8,0 1,202 28 25 30 18
47 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các kết quả cho thấy chủng TL1 có khả năng sinh trưởng trên các môi trường khác nhau, trong đó tốc độ sinh trưởng và khả năng tổng hợp enzym của chủng nghiên cứu đều thể hiện mạnh nhất trên môi trường LB. Có thể NaCl trong môi trường đã tạo ra nồng độ muối phù hợp cho sinh trưởng của các chủng này. Vì vậy, chúng tôi chọn môi trường LB là môi trường nuôi cấy thích hợp cho chủng TL1 trong các thí nghiệm tiếp theo.
Ảnh hưởng của pH ban đầu
Chủng TL1 được nuôi lắc 220 vòng/phút trên môi trường LB ở 28-30oC, pH ban đầu được chỉnh ở các giá trị từ 5 đến 9. Sau 2 ngày, xác định hoạt tính enzym, pH sau nuôi cấy và khả năng sinh trường của vi khuẩn. Kết quả được trình bày trong bảng 3.3 và bảng 3.4.
Qua bảng và biểu đồ ta thấy , pH ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng cũng như hoạt tính enzym chủng nghiên cứu. Nhìn chung, chủng TL1 thể hiện hoạt tính enzym cao ở pH trung tính hoặc kiềm yếu, còn ở pH thấp hoặc kiềm cao thì hoạt tính enzym giảm. Chủng TL1 ở pH=7 hoạt tính enzym thể hiện mạnh nhất.
Bảng 3.3: Ảnh hƣởng của pH lên khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzym của chủng TL1
pH đầu pH sau OD
Hoạt tính enzym (D-d,mm)
Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza
5 6,5 0,823 19 16 15 13
6 7,3 1,029 26 20 30 26
7 8,5 1,431 36 23 31 29
8 8,2 1,233 33 24 27 20
48
Hình 3.2: Ảnh hƣởng của pH lên khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzym của chủng TL 1
Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn TL1 trong di ̣ch LB ở pH =7. Dịch được lắc với vâ ̣n tốc 220 vòng/ phút trong nhiệt đô ̣ 30oC. Cứ sau 24 giờ lại lấy mẫu ra kiểm tra các thông số: pH, giá trị đo OD, hoạt tính enzym.
Bảng 3.4: Ảnh hƣởng của thời gian đến khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzym ngoại bào của chủng TL1
Thời gian
(giờ) pH sau OD
Hoạt tính enzym (D-d,mm)
Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza
24 7,0 0,704 19 15 21 17
48 8,1 1,484 32 26 32 35
72 8,4 1,253 25 23 28 26
49
Hình 3.3: Ảnh hƣởng của thời gian đến khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzym ngoại bào của chủng TL1
Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng TL1 sinh trưởng và sinh enzym ngoại bào mạnh nhất sau 48 giờ nuôi.
Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Chủng nghiên cứu được nuôi cấy trên môi trường LB với các nguồn cacbon khác nhau là: kitin, tinh bột tan, dextrin, glucoza, CMC, lactoza, bột ngô.
Bảng 3.5: Ảnh hƣởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzym của chủng TL1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nguồn C (1%)
pH
sau OD
Hoạt tính enzym (D-d,mm)
Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza
Kitin 8,0 1,246 29 20 24 21 Tinh bột 6,7 0,746 24 17 22 25 CMC 8,2 0,83 30 20 25 21 Glucoza 7,8 1,009 22 15 23 18 Lactoza 7,0 0,519 12 14 18 15 Bột ngô 8,5 1,561 34 25 26 24
50
Hình 3.4: Ảnh hƣởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzym của chủng TL1
Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng TL1 có khả năng sinh trưởng và sinh enzym ngoại bào trên 6 nguồn cacbon khác nhau. Chủng TL1 sinh trưởng và sinh enzym mạnh nhất ở môi trường có nguồn cacbon là bột ngô và yếu nhất với nguồn cacbon là lactoza. Kết quả cũng cho thấy rằng nguồn cacbon vừa là nguồn dinh dưỡng vừa là chất cảm ứng sinh tổng hợp enzym. Với nguồn cacbon là kitin thì khả năng sinh enzym kitinaza cao, cũng tương tự như vậy, enzym amylaza sinh ra nhiều nhất với nguồn cacbon là tinh bột, proteaza là bột ngô, xenlulaza là CMC.
Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Tiếp tục tiến hành khảo sát sự sinh trưởng và hoạt tính enzym của chủng TL1 trên 6 nguồn nitơ khác nhau. Kết quả như sau:
Bảng 3.6: Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến sinh trƣởng và hoạt tính enzym của chủng TL1 Nguồn N (1%) pH
sau OD
Hoạt tính enzym (D-d,mm)
Kitinaza Proteaza Xenlulaza Amylaza
NaNO2 7,2 0,359 19 15 20 16
NaNO3 7,3 0,763 21 18 24 20
51
Bột đậu tƣơng 7,5 1,870 34 27 30 28 Cao nấm men 8,4 1,534 30 24 32 27
Hình 3.5: Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến sinh trƣởng và hoạt tính enzym của chủng TL1
Kết quả cho thấy, chủng TL1 sử dụng được cả nguồn nitơ vô cơ cũng như nitơ hữu cơ, và sinh trưởng tốt hơn với nguồn nitơ hữu cơ. Đáng chú ý là với nguồn nitơ bột đậu tương chủng TL1 có khả năng sinh trưởng và sinh enzym mạnh nhất. Đây là nguồn nitơ dễ kiếm và rẻ tiền, rất phù hợp để sử dụng với mục đích sản xuất
3.1.1.3. Một số đặc điểm sinh học của chủng nghiên cứu
Chủng nghiên cứu được tiến hành kiểm tra các đặc điểm sinh học để bước đầu phân loại theo phương pháp vi sinh thông thường. Kết quả được trình bày ở bảng 3.7.
Bảng 3.7: Đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa của chủng nghiên cứu Đặc điểm Kết quả
Chủng TL1
Hình dạng khuẩn lạc Trắng, khô, bề mặt nhăn nheo
52
Kích thước tế bào 0,5 x 2,5 µm
Thuộc Gram (+) +
Khả năng di động + (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hiếu khí bắt buộc +
Khả năng chịu muối 10%
Khả năng sinh axit từ
glucoza -
Nội bào tử +
Hóa lỏng gelatin + Catalaza + Kitinaza 35 Amylaza 30 Proteaza 26 Xenlulaza 32
Kết quả ghi ở b ảng 3.7 ta thấy chủng TL 1 có dạng hình que , kích thước tế bào 0,5 x 2,5 µm, bắt màu Gram +, sinh nô ̣i bào tử , di đô ̣ng được và có khả năng sinh trưởng được trong môi trường chứa 2 -10% NaCl. Chủng TL1 không có khả năng khử sunfat và nitrat, không có khả năng sinh axit từ glucoza. Đặc biệt là chủng TL1 có khả năng sinh nhiều enzym với hoạt tính rất mạnh và rất cần thiết co việc phân giải các chất hữu cơ không mong muốn trong môi trường nuôi tôm cá .
Đối chiếu những đặc điểm của chủng TL1 trình bày ở bảng 3.7 với khóa phân loại Bergey chúng tôi khẳng định rằng chủng này thuộc chi Bacillus.
Chủng Bacillus TL1 phân lâ ̣p được là chủng có khả năng sinh trưởng tốt trên các nguồn cơ chất đơn giản và có khả năng sinh hàng loạt enzym ngoại bào như proteaza, xenlulaza, kitinaza và amylaza . Vì những ưu điểm trên , chủng Bacillus TL1 rất đáng được xem xét để đưa vào sản xuất chế phẩm probiotic dùng trong xử lý ô nhiễm nước đầm nuôi trồng thủy sản.
53
3.1.2. Vi khuẩn Lactic
3.1.2.1. Phân lập và tuyển chọn
Như đã đề cập ở phần 1.5.1, nhóm vi khuẩn lactic là một trong những nhóm vi khuẩn điển hình có ích đối với môi trường đầm nuôi trồng thủy sản. Nhiều loa ̣i vi khuẩn lactic c ó khả năng tổng hợp các chất kháng khuẩn có khả năng ức chế sinh trưởng của các vi khuẩn gây bê ̣nh , trong đó có vi khuẩn Vibrio. Các chất kháng khuẩn đươ ̣c xem như là các chất kháng sinh tự nhiên , không dùng trong y tế , không gây đô ̣c ha ̣i cho con người và môi trường , dễ phân giải sau mô ̣t thời gian sử du ̣ng nên không để la ̣i dư lượng trong sản phẩm. Vì vậy chúng tôi đã tiếp tục thực hiện đề tài với đối tượng là vi khuẩn lactic.
Từ tập hợp các chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ các mẫu lên men chua trên môi trường MRS, chúng tôi đã tuyển chọn được chủng L5 có khả năng sinh bacteriocin kháng mạnh với Vibrio parahaemolyticus (25mm).
Bảng 3.8: Hoạt tính ức chế các vi sinh vật kiểm định của chủng L5 Chủng Hoạt tính kháng khuẩn (D-d,mm)
V. parahaemolyticus E. coli Salmonella typhi
L5 25 20 9
3.1.2.2. Phân loại
Phân loại theo phƣơng pháp truyền thống
Các đặc điểm sinh học của chủng L5 được trình bày trong bảng 15.
Bảng 3.9: Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng L5
Đặc điểm Kết quả
Hình dạng khuẩn lạc Tròn, trắng đục
Hình dạng tế bào Que ngắn, xếp đơn lẻ hoặc tạo chuỗi ngắn
Kích thước tế bào 0,5 - 1,5 µm
Khả năng hình thành bào tử -
Hiếu khí tùy tiện +
54
Catalaza -
Khả năng di động - (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khả năng sinh axit 24,5 mg/l
Hoạt tính enzym ngoại bào (D-d,mm)
Proteaza 18
Xenlulaza 9
Amylaza 12
Khả năng đồng hóa đƣờng
Glucozơ + Tinh bột ± Dextrin + Lactozơ ± Sorbitol - Maltozơ +
Các kết quả ghi ở bảng 3.10 cho thấy, chủng vi khuẩn L 5 có dạng que ngắn , kích thước 0,5 – 1 µm, nhuộm Gram +, không có khả năng di đô ̣ng và không hình thành bào tử. Đây là vi khuẩn hiếu khí tùy tiê ̣n không có phản ứng catalase . Chủng L5 có khả năng đồng hóa nhiều loại đường . Khi so sánh các đặc điểm trên với khóa phân loại Bergey cho thấy chủng L5 là vi khuẩn lactic điển hình thuộc chi
Lactobacillus [62].
Phân loại theo phƣơng pháp sinh học phân tử
Trình tự rARN 16S của chủng L5 TTGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGCCTAAAGAATCTAATACGACTGTTGAAATTTC AGCACCCGCACTTTAGCAGCAATTGAACGGGCATCCCTGTTATCCCACGAAAGTCGCAAT AATGTGGTTCGCTTCTCCGTTAACCAACGGACAAAACGATTACGATACATTTATCAAACGC TACAGGCCTTATATCAGCAACAACAAGAACGCTTTCGGTAACTCACCAGATGTCGGGGAA GTAACGGAACAACTACAGCCCACTGATTTGTCAGGTGACGAACTTGAAATTTCATTTAACC CAGACTACATGAAAGAAGCGTTACGTTCGTTTGGGCAAGCTATGATCAAAATCTCATTCAC GATGGCATTGCGCCCATTCACTTTAGTGCCAACTGAAGAAGGCGAAAACTTTATTCAGTTG ATTACACCAGTTCGAACGTTTTAATTAGCTGAATAAATATACAATTCTAAATAAAAGGCCC
55 GCATTTCACCGTGAAATGCGGGCCTTTTATGACGGCTAAAACTAGCTAAAGATGGGGCAA TGAATAGGCAATAGCGATGATGTAACTTTTGAAGTTTTAACTTATGCATATTATATTAGCT GCTGGTGAATTGTCACGCTAACTATCGATGTTGCCCTACTAAAATCCCACCATCTGATGAA CCCCAGTCCTTGCACTCGTTCGCTACAAACGCTCGCTTTCAGATAATGAATGCTGGCTTTA GCCAATTTTTATAGGTAAAAAACAAGATATTTTATTAAAATCCGCAAAATTAGGGAATTTC AGCAAATTTACCCCTAGGCTAGTATCCCGATATTAAAAAGCCCTAAATCGTCTTAAAATGG CTCTGAGTGCGGTTATAAATTGAATTTTCATCAAAAAACAAGTATAATATAACCTGTTAGG AGTGTGTGTAGCACGCCAGACAGTCGTTTAATAGCTTGTAATCAGATAGGCAGGTGACAT TGTGAAACAGCCAATAGATATTAAAACCCCATATATGACGTTGGGGCAACTCTTAAAAGAA ACGGCCATCATTGGATCGGGTGGTCAGGCGAAGTGGTTCTTAAAAGAAACAACCGTGTTA GTTAATGGTGAACCAGATGATCGGCGGGGTCGGAAACTTTATCCAGGCGATACGATTGAA GTTGAAGACAACGGGTCATTTTTTATTCGCTCAAATCAAGAAACGACTGATTAGATGTACT TAGAAAACTTAGTCTTGCATGATTTTCGGAACTACGCGGATTTGACCATTAATTTTAGTCA GGGCGTTAATGTTCTATTAGGTGAAAATGCGCAGGGAAAGACGAACCTGTTGGAAGCCAT TTATGTGTTGGCGTTAACGCGTAGTCACCGCACCGCTAACGATAAGGAATTAATTCGGTG GCAAACCACCACGGCAACGTTGCAAGGCCGGTTACATAAAAGTACCGGTGCTGTCCCCTT GGAACTTGAATTGGGGCGGCGGGGCAAGCGAGCGAAAGTCAATCATCTTGAGCAAGCCA AATTATCCCAGTACGTCGGAAATTTGAACGTGATCGTGTTTGCACCTGAAGATTTATCCAT CGTTAAAGGGGCACCCGCGGTTCGCCGTCGGTTTATGGATATGGAATTTGGTCAGATGAG CCCTAAATACCTCTATAACCTAAGTCAGTATCGCACGATTTTAAAACAACGTAATCAATAC TTACGGCAATTAAATCGGCAGCAGGCCAAGGATAAGGTTTATTTGGGTGTCTTGTCGGAT CAATTGGCTGCATTTGGTGCGGAAATCATCCATAAACGACTACAACTGTTGCAGCAACTTG AGAAATGGGCGCAAGCTGTTCACAGCGAGATTACGCAAGTGGACAGGCTGGATCACCTCC TTT
Hình 3.6: Trình tự nucleotit của rARN 16S của chủng L5
Xây dựng cây phân loại
So sánh trình tự rARN 16S của chủng L5 bằng phần mềm CLUSTAL và với các trình tự đã có sẵn thuộc chi Lactobacillus trong ngân hàng gen (Genbank), chúng tôi đã xây dựng được cây chủng loại phát sinh (hình 3.7).
56
Hình 3.7: Vị trí phân loại của chủng L5 và các loài có quan hệ họ hàng gần
So sánh với dữ liệu trong ngân hàng gen Quốc tế xác định được trình tự gen rARN 16S của chủng L5 tương đồng 99,9 % với đoạn rARN 16S của vi khuẩn
Lactobacillus plantarum.
3.1.2.3. Ảnh hưởng của một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tổng hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum L5
Ảnh hưởng của pH ban đầu
L. plantarum L5 được nuôi cấy trên dịch MRS có pH thay đổi từ 4 đến 8, ở nhiệt độ 320C 2, trong 48h. Sau đó đem di ̣ch đo pH và phân tích khả năng sinh trưởng, khả năng kháng khuẩn . Đối với các thí nghiệm xác định khả năng đối kháng, dịch nuôi cấy được trung hòa bằng kiềm NaOH (0,1 N) tới pH trung tính để chắc chắn rằng vòng vô khuẩn ta ̣o ra không phải do axit mà là bacteriocin do vi khuẩn tiết ra. Kết quả được biểu diễn ở bảng 3.10.
PHYLIP_1 Streptomyces AB217603
L5 Lactobacillus plantarum GQ289387 1 00 Lactobacillus paracollinoides Lactobacillus lacrimicola Lactobacillus paraplantarum Lactobacillus durianis Lactobacillus sp AF51 6 8 6 0
Lactobacillus suebicus AB2
Lactobacillus sp AJ78
1 00
8 0
Lactobacillus uvarum EU3
Lactobacillus pentosus AB36 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lactobacillus vaccinostercus 8 5 6 6 Lactobacillus collinoides Lactobacillus paralimentarius 9 2 6 2 8 2 8 0 8 0
57
Bảng 3.10: Ảnh hƣởng của pH đến sự sinh trƣởng và khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum L5
pH đầu pH sau OD Hoạt tính kháng khuẩn (D-d,mm) Vibrio parahaemolyticus E.coli Salmonella typhi 4 3,8 0,468 11 9 2 5 3,6 0,924 21 18 5 6 4,0 1,207 25 20 10 7 4,5 1,354 24 19 9 8 5,2 1,173 18 15 3
Qua bảng ta thấy rằng L. plantarum L5 sinh trưởng được trên dải pH rộng, trong đó pH= 6 - 7 là phù hợp nhất cho sự sinh trưởng và hoạt tính kháng khuẩn. Ở pH hơi kiềm thì các chỉ số này có xu hướng giảm, còn ở pH = 4 khả năng sinh trưởng của L. plantarum L5 kém.
Hình 3.8: Ảnh hƣởng của pH đến sự sinh trƣởng và khả năng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum L5
58
Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Tiến hành nuôi cấy chủng L5 trên môi trường dịch MRS, cứ sau 24h xác định các chỉ số pH, OD và hoạt tính kháng khuẩn. Kết quả cho thấy thời gian L. plantarum L5 sinh trưởng và tổng hợp chất kháng khuẩn mạnh nhất là sau 48 giờ.
Bảng 3.11: Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh trƣởng và khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum L5
Thời gian (giờ) OD pH Hoạt tính kháng khuẩn (D-d,mm) Vibrio parahaemolyticus E.coli Salmonella typhi 24 0,804 4,8 15 8 0 48 1,085 4,3 25 19 10 72 0,988 4,5 21 14 5 96 0,721 5,0 18 11 3
Hình 3.9: Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh trƣởng và sinh chất kháng khuẩn của L. plantarum L5
59
Tiến hành nuôi cấy L. plantarum L5 trên môi trường dịch MRS có bổ sung