Các mẫu lá của 34 giống ựậu tương ựược rửa sạch và tách DNA. để hạn chế sự phân hủy DNA, việc tách chiết DNA ựược tiến hành trong ựiều kiện nhiệt ựộ thấp nhằm ức chế sự hoạt ựộng của các enzyme này. Do vậy, trước khi nghiền mẫu, cối và chày sứ ựược giữ trong tủ lạnh -80oC. Mẫu sau ựó ựược tiến hành nghiền trong nitơ lỏng. Sau khi nghiền thành dạng bột mịn, mẫu ựược hòa tan trong dung dịch ựệm chiết. Hỗn hợp dung dịch ựệm này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, ựồng thời giải phóng DNA ra môi trường. Thành phần CTAB trong ựệm chiết không những có tác dụng phá vỡ tế bào mà còn có vai trò ức chế sự hoạt ựộng của các nuclease. Trong khi ựó, EDTA lại có tác dụng cố ựịnh các ion Mg2+ (là yếu tố cần thiết cho sự hoạt ựộng của các nuclease), nên sẽ ngăn không cho các nuclease phân giải DNA trong quá trình tách chiết.
để loại bỏ protein trong hỗn hợp, mẫu ựược bổ sung hỗn hợp: chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1). Chloroform làm biến tắnh protein nhưng không làm ảnh hưởng ựến cấu trúc của DNA, ựồng thời nó còn tạo ựiều kiện thuận lợi cho việc tách pha nước với pha hữu cơ. Isoamyl alcohol có tác dụng làm giảm bọt khắ trong quá trình tách chiết. Sau khi lắc mạnh và ựem ly tâm, hỗn hợp ựược phân làm 3 pha: pha trên cùng là pha nước có chứa DNA, pha giữa là protein ựã bị biến tắnh, pha dưới cùng là hỗn hợp chloroform và isoamyl alcohol. Pha nước ựược hút nhẹ nhàng sang ống mới.
Tiếp theo là bước kết tủa DNA bằng cồn tuyệt ựối, cồn có tác dụng hút lớp nước bao quanh phân tử DNA ựể lộ ra các gốc phosphate tắch ựiện âm. Khi ựó các ion Na+ kết hợp với các gốc phosphate này khiến cho lực ựẩy giữa các chuỗi nucleotide giảm, do ựó DNA bị kết tủa. Ở ựiều kiện -20oC trong 15 giờ thì DNA
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 34
kết tủa gần như hoàn toàn. Trong dung dịch này có lẫn nhiều RNA, vì thế chúng tôi ựã tiến hành loại RNA bằng cách ủ dung dịch với RNase 0,01mg/ml ở 37oC trong 2 - 3 giờ. DNA tổng số sau ựó ựược ựiện di trên gel agarose 0,8% ựể kiểm tra chất lượng và nồng ựộ.
Do có cấu trúc dạng mạng lưới, nên sau khi ựiện di các ựoạn DNA có kắch thước và trọng lượng khác nhau sẽ di chuyển với tốc ựộ khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc và trọng lượng phân tử của chúng. DNA tổng số có kắch thước và trọng lượng phân tử lớn nhất nên dưới tác dụng của dòng ựiện một chiều, DNA tổng số sẽ di chuyển chậm và chiếm vị trắ cao nhất trên bản gel. Những ựoạn DNA có kắch thước nhỏ hơn (do bị phân hủy) và các phân tử RNA chạy nhanh hơn tạo thành vệt sáng phắa dưới vạch DNA tổng số.
Hình 4.1. Hình ảnh ựiện di DNA tổng số của các giống ựậu tương
Giếng 1-16: giống theo thứ tự D1-D16
Trong cấu trúc của phân tử DNA có các liên kết hydro giữa 2 mạch ựơn nên trong quá trình nhuộm, các phân tử EtBr sẽ bám vào các liên kết này. Phân tử EtBr có khả năng phát quang dưới ánh sáng của tia tử ngoại (UV), nên ta có thể phát hiện ựược các băng vạch khi chiếu bản gel dưới ánh sáng UV. Sau khi nhuộm bản gel trong dung dịch EtBr 15 phút, các băng DNA ựã xuất hiện rõ nét dưới ánh sáng tử ngoại. Kết quả tách chiết DNA các giống ựậu tương ựược thể hiện trên hình 4.1.
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 35
Trên hình, các băng diện di DNA tổng số cho kết quả gọn, rõ nét, chứng tỏ DNA có ựộ nguyên vẹn cao, không bị lẫn tạp chất. DNA ựược ựo OD ựể kiểm tra chất lượng DNA cũng như nồng ựộ của chúng và pha loãng ựến nồng ựộ thắch hợp ựể tiến hành các thắ nghiệm tiếp theo.
Bảng 4.1. Hàm lượng và ựộ tinh sạch DNA của 34 giống ựậu tương nghiên cứu
STT Tên giống OD260/280 Hàm Lượng (ng/ộl) STT Tên giống OD260/280 Hàm Lượng (ng/ộl) 1 D1 1,83 179,1 18 D18 1,89 204,7 2 D2 1,80 342,6 19 D19 1,85 253,1 3 D3 1,89 310,2 20 D20 1,85 137,5 4 D4 1,88 440,4 21 D21 1,81 111,5 5 D5 1,86 210,1 22 D22 1,88 262,2 6 D6 1,86 182,2 23 D23 1,87 403,2 7 D7 1,83 376,6 24 D24 1,84 330,0 8 D8 1,81 490,2 25 D25 1,88 601,9 9 D9 1,80 405,1 26 D26 1,85 431,2 10 D10 1,83 297,5 27 D27 1,83 738,4 11 D11 1,83 589,8 28 D28 1,88 432,4 12 D12 1,84 556,0 29 D29 1,88 255,7 13 D13 1,86 262,6 30 D30 1,90 561,7 14 D14 1,85 373,7 31 D31 1,83 433,5 15 D15 1,87 390,9 32 D32 1,90 716,4 16 D16 1,83 646,6 33 D33 1,91 617,8 17 D17 1,84 199,6 34 D34 1,88 411,7
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 36
Sau khi kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp quang phổ hấp thụ, chúng tôi ựã xác ựịnh ựược hàm lượng DNA tách chiết từ các giống ựậu tương, kết quả ựã ựược thể hiện qua bảng 4.1. Phổ hấp thụ DNA của các giống ựậu tương có tỷ số A206/A280 dao ựộng trong khoảng 1,81 - 1,91. Các mẫu DNA tổng số ựược tách từ lá của các giống ựậu tương có hàm lượng cao dao ựộng từ 111,5 Ờ 738,4 ng/ộl. Kết quả tách chiết DNA tốt, DNA ựược pha loãng ra nồng ựộ 50ng/ộl ựể tiến hành phản ứng PCR - SSR