Xử lý kết quả phân tắch SSR theo Nei (1987) [36].
Dựa vào ảnh ựiện di sản phẩm PCR và sự xuất hiện các băng SSR của các giống ựậu tương ựối với các mồi ựể làm cơ sở cho việc phân tắch số liệu.
Phân tắch số liệu theo quy ước: - Số 1 - xuất hiện băng SSR.
- Số 0 - không xuất hiện băng SSR. Các số liệu này ựược nhập vào phần mềm Excel theo từng mồi.
Hệ số ựa dạng di truyền H cho mỗi chỉ thị phân tử ựược tắnh theo công thức: H = 1 - ∑ Pi2
Trong ựó Pi là tần suất lặp alen thứ i của mỗi chỉ thị phân tử.
Lập cây phân loại: Số liệu ựược ựưa vào phần mềm chuyên dụng NTSYS pc version 2.0 ựể tìm ra sự sai khác giữa các giống ựậu tương thông qua biểu ựồ cây ở hệ số tương ựồng Jaccard. Phân tắch và ựánh giá hệ số tương quan kiểu hình theo phương pháp phân nhóm UPGMA.
Sau ựó sử dụng phần mềm NTYSYS 2.1x ựể lập biểu ựồ phân nhóm 2 chiều dựa trên phân tắch PCA (principal Coordinate analysis) qua ựó sẽ lập thêm phân nhóm dựa trên khoảng cách di truyền giữa các dòng, giống ựậu tương nghiên cứu.
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 33
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1.Kết quả ựánh giá ựa dạng di truyền của 34 giống ựậu tương
4.1.1. Kết quả tách DNA tổng số
Các mẫu lá của 34 giống ựậu tương ựược rửa sạch và tách DNA. để hạn chế sự phân hủy DNA, việc tách chiết DNA ựược tiến hành trong ựiều kiện nhiệt ựộ thấp nhằm ức chế sự hoạt ựộng của các enzyme này. Do vậy, trước khi nghiền mẫu, cối và chày sứ ựược giữ trong tủ lạnh -80oC. Mẫu sau ựó ựược tiến hành nghiền trong nitơ lỏng. Sau khi nghiền thành dạng bột mịn, mẫu ựược hòa tan trong dung dịch ựệm chiết. Hỗn hợp dung dịch ựệm này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, ựồng thời giải phóng DNA ra môi trường. Thành phần CTAB trong ựệm chiết không những có tác dụng phá vỡ tế bào mà còn có vai trò ức chế sự hoạt ựộng của các nuclease. Trong khi ựó, EDTA lại có tác dụng cố ựịnh các ion Mg2+ (là yếu tố cần thiết cho sự hoạt ựộng của các nuclease), nên sẽ ngăn không cho các nuclease phân giải DNA trong quá trình tách chiết.
để loại bỏ protein trong hỗn hợp, mẫu ựược bổ sung hỗn hợp: chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1). Chloroform làm biến tắnh protein nhưng không làm ảnh hưởng ựến cấu trúc của DNA, ựồng thời nó còn tạo ựiều kiện thuận lợi cho việc tách pha nước với pha hữu cơ. Isoamyl alcohol có tác dụng làm giảm bọt khắ trong quá trình tách chiết. Sau khi lắc mạnh và ựem ly tâm, hỗn hợp ựược phân làm 3 pha: pha trên cùng là pha nước có chứa DNA, pha giữa là protein ựã bị biến tắnh, pha dưới cùng là hỗn hợp chloroform và isoamyl alcohol. Pha nước ựược hút nhẹ nhàng sang ống mới.
Tiếp theo là bước kết tủa DNA bằng cồn tuyệt ựối, cồn có tác dụng hút lớp nước bao quanh phân tử DNA ựể lộ ra các gốc phosphate tắch ựiện âm. Khi ựó các ion Na+ kết hợp với các gốc phosphate này khiến cho lực ựẩy giữa các chuỗi nucleotide giảm, do ựó DNA bị kết tủa. Ở ựiều kiện -20oC trong 15 giờ thì DNA
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 34
kết tủa gần như hoàn toàn. Trong dung dịch này có lẫn nhiều RNA, vì thế chúng tôi ựã tiến hành loại RNA bằng cách ủ dung dịch với RNase 0,01mg/ml ở 37oC trong 2 - 3 giờ. DNA tổng số sau ựó ựược ựiện di trên gel agarose 0,8% ựể kiểm tra chất lượng và nồng ựộ.
Do có cấu trúc dạng mạng lưới, nên sau khi ựiện di các ựoạn DNA có kắch thước và trọng lượng khác nhau sẽ di chuyển với tốc ựộ khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc và trọng lượng phân tử của chúng. DNA tổng số có kắch thước và trọng lượng phân tử lớn nhất nên dưới tác dụng của dòng ựiện một chiều, DNA tổng số sẽ di chuyển chậm và chiếm vị trắ cao nhất trên bản gel. Những ựoạn DNA có kắch thước nhỏ hơn (do bị phân hủy) và các phân tử RNA chạy nhanh hơn tạo thành vệt sáng phắa dưới vạch DNA tổng số.
Hình 4.1. Hình ảnh ựiện di DNA tổng số của các giống ựậu tương
Giếng 1-16: giống theo thứ tự D1-D16
Trong cấu trúc của phân tử DNA có các liên kết hydro giữa 2 mạch ựơn nên trong quá trình nhuộm, các phân tử EtBr sẽ bám vào các liên kết này. Phân tử EtBr có khả năng phát quang dưới ánh sáng của tia tử ngoại (UV), nên ta có thể phát hiện ựược các băng vạch khi chiếu bản gel dưới ánh sáng UV. Sau khi nhuộm bản gel trong dung dịch EtBr 15 phút, các băng DNA ựã xuất hiện rõ nét dưới ánh sáng tử ngoại. Kết quả tách chiết DNA các giống ựậu tương ựược thể hiện trên hình 4.1.
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 35
Trên hình, các băng diện di DNA tổng số cho kết quả gọn, rõ nét, chứng tỏ DNA có ựộ nguyên vẹn cao, không bị lẫn tạp chất. DNA ựược ựo OD ựể kiểm tra chất lượng DNA cũng như nồng ựộ của chúng và pha loãng ựến nồng ựộ thắch hợp ựể tiến hành các thắ nghiệm tiếp theo.
Bảng 4.1. Hàm lượng và ựộ tinh sạch DNA của 34 giống ựậu tương nghiên cứu
STT Tên giống OD260/280 Hàm Lượng (ng/ộl) STT Tên giống OD260/280 Hàm Lượng (ng/ộl) 1 D1 1,83 179,1 18 D18 1,89 204,7 2 D2 1,80 342,6 19 D19 1,85 253,1 3 D3 1,89 310,2 20 D20 1,85 137,5 4 D4 1,88 440,4 21 D21 1,81 111,5 5 D5 1,86 210,1 22 D22 1,88 262,2 6 D6 1,86 182,2 23 D23 1,87 403,2 7 D7 1,83 376,6 24 D24 1,84 330,0 8 D8 1,81 490,2 25 D25 1,88 601,9 9 D9 1,80 405,1 26 D26 1,85 431,2 10 D10 1,83 297,5 27 D27 1,83 738,4 11 D11 1,83 589,8 28 D28 1,88 432,4 12 D12 1,84 556,0 29 D29 1,88 255,7 13 D13 1,86 262,6 30 D30 1,90 561,7 14 D14 1,85 373,7 31 D31 1,83 433,5 15 D15 1,87 390,9 32 D32 1,90 716,4 16 D16 1,83 646,6 33 D33 1,91 617,8 17 D17 1,84 199,6 34 D34 1,88 411,7
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 36
Sau khi kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp quang phổ hấp thụ, chúng tôi ựã xác ựịnh ựược hàm lượng DNA tách chiết từ các giống ựậu tương, kết quả ựã ựược thể hiện qua bảng 4.1. Phổ hấp thụ DNA của các giống ựậu tương có tỷ số A206/A280 dao ựộng trong khoảng 1,81 - 1,91. Các mẫu DNA tổng số ựược tách từ lá của các giống ựậu tương có hàm lượng cao dao ựộng từ 111,5 Ờ 738,4 ng/ộl. Kết quả tách chiết DNA tốt, DNA ựược pha loãng ra nồng ựộ 50ng/ộl ựể tiến hành phản ứng PCR - SSR
4.1.2. Kết quả PCR- SSR trên ựiện di polyacrylamide
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 15 cặp mồi SSR (Bảng 3.2) trong phản ứng PCR - SSR ựể nhân bản các phân ựoạn DNA từ hệ gen của 34 giống ựậu tương. Sản phầm PCR - SSR ựược kiểm tra trên gel agarose 1,5%. Sau ựó, các phân ựoạn PCR - SSR ựược phân tách trên ựiện di polyacrylamide 6% và nhuộm bạc. Trong số 15 chỉ thị SSR sử dụng ựể phân tắch sự ựa dạng di truyền của 34 giống ựậu tương thì tất cả 15 chỉ thị SSR ựều cho tắnh ựa hình.
Kết quả phân tắch hình ảnh ựiện di sản phẩm SSR của 15 cặp mồi ựược trình bày trên hình 4.2. Ở tất cả 34 giống ựậu tương ựược nghiên cứu, các băng PCR nhân lên ựặc hiệu cho từng chỉ thị phân tử SSR và có kắch thước của ựoạn SSR gần với kắch thước tương ứng của từng chỉ thị SSR. Thống kê các phân ựoạn DNA ựược nhân bản, chúng tôi ựã phát hiện ựược 61 alen, số alen ựa hình của mỗi chỉ thị SSR biến ựộng từ 2 ựến 7 và ựạt trung bình là 4 alen (bảng 4.2).
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 37
Hình 4.2. Phổ ựiện di sản phẩm PCR của một số cặp mồi SSR (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
M: Marker 100bp
Giếng 1-34: các giống ựậu tương D1-D34
Trên cơ sở phân tắch kết quả thống kê các alen, chỉ số ựa dạng di truyền của từng chỉ thị SSR ựã ựược thể hiện qua bảng 4.2 cho thấy 2 chỉ thị Sat_182, Sat_298 cho sự ựa dạng cao nhất là 7 alen và các chỉ thị cho sự ựa dạng thấp nhất là 2 alen cho mỗi chỉ thị phân tử như Satt364 và Satt622. Sử dụng các chị thị SSR nghiên cứu tắnh ựa dạng trên thế giới thường ựạt từ 5 ựến 11 allen cho mỗi chỉ chị [16] [35].
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 282930 31 32 33 34 M M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 M 300 bp 300 bp 200 bp Satt596 300 bp Sat_182 300 bp Satt529 Satt412
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 38
Bảng 4.2. Kết quả phân tắch sự ựa hình của các chỉ thị SSR
STT Tên mồi Dạng SSR Kắch thước
alen (bp) Số alen Chỉ số ựa dạng (H) 1 Satt364 (TAA)15 340 - 350 2 0,541 2 Satt449 (TTA)21 200 - 300 5 0,7720 3 Sat_182 AT)26 200 - 300 7 0,811 4 Satt412 (ATT)17 200 - 300 5 0,6643 5 Sat_298 (AT)28 200 - 300 7 0.785 6 Satt622 (AAT)27 180 - 200 2 0,4995 7 Satt596 (ATT)17 250 - 320 4 0,6245 8 Sat_259 (AT)22 200 - 300 3 0,1608 9 Satt456 (ATT)9 350 - 450 5 0,7 10 Satt547 (CAT)4(TAT)17 550 - 600 3 0,5 11 Satt370 (TA)37 750 - 950 3 0,6122 12 Satt183 (ATT)13 640 - 690 4 0,7145 13 Satt654 (ATA)5acaataac(AAT)4 720 - 750 3 0,4489 14 Satt529 (ATT)13 220 - 240 5 0,7730 15 Sat_228 (AT)40 210 3 0,6465 Tổng 61 TB 4 0,5666
Giá trị chỉ số ựa dạng (H) của các chỉ thị SSR biến ựộng từ 0,1608 ựến 0,811. Chỉ số ựa dạng di truyền trung bình cho các chỉ thị SSR là 0,5666. Trong ựó, chỉ thị Sat_182 có chỉ số ựa dạng cao nhất là 0,811, còn Sat_259 cho sự ựa dạng thấp nhất
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 39
là 0,1608. Ngoài ra, có thể thấy các chỉ thị SSR cho sự ựa dạng cao giữa 34 giống ựậu tương ựược nghiên cứu như: Sat_298 là 0,785; Satt529 là 0,7730; Satt449 là 0,7720; Satt183 là 0, 7145; Satt596 là 0,6245 và Satt370 là 0,6122.
Chỉ số ựa dạng giữa 34 giống ựậu tương chúng tôi nghiên cứu thấp hơn so với nghiên cứu của Trần Thị Phương Liên và Lê Thị Muội (2003) [9] trên 7 kiểu gen ựậu tương Việt Nam (chỉ số ựa dạng trung bình 0,6326), thấp hơn so với nghiên cứu của Abe và cs (2003) [16] trên tập ựoàn 131 giống ựậu tương từ 14 nước Châu Á (chỉ số ựa dạng trung bình 0,782). Tuy nhiên chỉ số này tương ựương so với nghiên cứu của Narvel và cs (2000) [35] trên 74 giống ựậu tương ở Bắc Mỹ (chỉ số ựa dạng trung bình 0,56).
4.1.3. Kết quả lập cây phân loại
Sau khi chạy ựiện di polyacrylamide gel, chúng tôi tiến hành lập bảng ựể so sánh các băng ựa hình trong ựó băng lên ựược ký hiệu 1 và băng không xuất hiện ựược ký hiệu 0. Sử lý với phần mền NTSYSpc version 2.0 ựể tắnh hệ số tương ựồng di truyền và xây dựng biểu ựồ quan hệ di truyền giữa các dòng ựậu tương. Sau ựó dựa vào hệ số tương ựồng di truyền chúng tôi xây dựng ựược sơ ựồ hình cây của 34 giống ựậu tương ựược thể hiện trên hình 4.3. Phân tắch sơ ựồ hình cây cho thấy 34 giống ựậu tương nghiên cứu ựược chia thành hai nhánh rõ rệt và chia thành hai nhóm lớn là nhóm I, nhóm 2, có khoảng cách di truyền giữa hai nhóm là 0,76.
Nhóm I gồm 22 giống ựậu tương và ựược chia tiếp thành hai nhánh nhỏ hơn, nhánh thứ nhất chắnh là phân nhóm Id, nhánh thứ hai bao gồm 3 phân nhóm Ia, Ib, Ic. Trong ựó phân nhóm Ia gồm các giống D1, D18, D9, D25, D3, D7, D23, D24, D31, D32, D33, D34, D19; phân nhóm Ib gồm 5 giống D8, D11, D28, D29 và D30; phân nhóm Ic gồm 2 giống D10 và D22 và phân nhóm Id gồm 2 giống D4 và D16. Nhóm II bao gồm 12 giống còn lại và ựược chia thành hai nhánh nhỏ hơn, nhánh thứ nhất là phân nhóm IIc, nhánh thứ hai gồm hai phân nhóm IIa và IIb.
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 40
Trong ựó phân nhóm IIa gồm các giống D2, D5, D15, D14, D14, D26 và D17; phân nhóm IIb có giống D27; phân nhóm IIc có các giống D6, D12, D21, D20.
Hình 4.3. Sơ ựồ cây phân loại của 34 giống ựậu tương
Trong số 7 phân nhóm trên ta thấy ở phân nhóm Ia có giống D9 và giống D25, giống D32 và giống D33 ựều có hệ số tương ựồng là 0,74. điều ựó chứng tỏ, giống D9 và giống D25; giống D32 và giống D33 có nguồn gốc gần nhau, có những ựặc ựiểm sinh trưởng và phát triển tương ựồng với nhau. Về mặt phát sinh giống thì các giống ựậu tương D9 và D25, D32 và D33 có thể có chung nguồn gốc là từ cùng một giống ựậu tương nào ựó.
Hai phân nhóm Ia, Ib hầu hết các giống ựều có chung nguồn gốc Việt Nam, ngoài trừ giống D3 có nguồn gốc Thái Lan, giống D18 và D23 có nguồn gốc Trung Quốc. Trong số ựó, các giống nguồn gốc Việt Nam có giống D11 là có thời gian sinh trưởng thấp nhất 88 ngày, giống D29 có thời gian sinh trưởng dài nhất là 120 ngày.
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 41
Các giống ựậu tương trong các phân nhóm Ic, Id, IIa, IIb và IIc có nguồn gốc khác nhau như Việt Nam, đài Loan, Trung Quốc, Mỹ, Úc và Thái Lan. Các giống ựậu tương ựó có hai màu hoa khác nhau là trắng và tắm nhưng ựều cho hạt màu vàng. Trong số ựó, các giống ựậu tương Việt Nam có thời gian sinh trưởng thấp nhất là 80 ngày và thời gian sinh trưởng cao nhất là 113 ngày; các giống ựậu tương nguồn gốc Trung Quốc có thời gian sinh trưởng thấp nhất là 75 ngày và thời gian sinh trưởng cao nhất là 90 ngày; các giống ựậu tương đài Loan có thời gian sinh trưởng thấp nhất là 88 ngày và thời gian sinh trương cao nhất là 113 ngày; các giống ựậu tương Úc có hai giống với thời gian sinh trưởng là 98 ngày và 105 ngày; còn Mỹ và Thái Lan ựều chỉ có một giống ựậu tương với thời gian sinh trưởng là 105 ngày.
Dựa theo ựặc ựiểm sinh trưởng và phát triển của các giống ựậu tương (bảng 3.1) , về năng suất các giống ựậu tương có năng suất khác nhau: năng suất cao như giống D1, D3, D4, D5Ầ; năng suất trung bình như giống D2, D16, D23, D27Ầ và năng suất thấp như giống D7, D8, D12, D13Ầ Năng suất của các giống ựậu tương là một chỉ tiêu quan trọng trong việc lai tạo giống ựậu tương sau này. Trong việc chọn cặp lai thì thường tiến hành chọn giống ựậu tương có năng suất cao lai với giống ựậu tương có tắnh kháng bệnh cao.
Về khả năng kháng bệnh phấn trắng trong tự nhiên thì các giống ựậu tương có 5 mức phản ứng với bệnh khác nhau: giống kháng cao, giống kháng, giống kháng trung bình, giống nhiễm nặng và giống nhiễm rất nặng. Theo sơ ựồ hình cây của 34 giống ựậu tương, kết hợp với tắnh kháng bệnh phấn trắng tự nhiên của các giống ựậu tương (bảng 3.1) cho thấy những giống ựậu tương thuộc nhóm I là những giống ựậu tương mẫn cảm với bệnh phấn trắng, còn những giống ựậu tương thuộc nhóm II là những giống ựậu tương có khả năng kháng bệnh phấn trắng ơ các mức