Kỹ thuật SSR có thể ựược ứng dụng trong nghiên cứu ựa dạng di truyền và trong chọn giống thực vật. Lần ựầu tiên sự thể hiện của SSR về những biến ựổi ở mức ựộ alen và tắnh di truyền ựược tìm thấy ở một loài thực vật là ựậu tương và ựây là một trong những chỉ thị phân tử dựa trên kỹ thuật PCR thành công nhất hiện nay. Akaya và CS (1992) [17] ựã phân tắch ựa dạng di truyền trên 43 giống ựậu tương ở Bắc và Nam Mỹ. Kết quả cho thấy SSR có sự ựa hình cao và ựa dạng alen cho từng locus với trình tự AT và ATT. Tiếp theo, Rongwen và cs (1995) [44] ựã công bố về những biến ựổi alen của SSR ở mức ựộ cao trong sinh chất mầm ựậu tương. Theo ông, có 28 alen SSR ựược nhắc lại trong nhóm 96 kiểu gen ựậu tương. Akaya và CS (1995) [17] ựã lập bản ựồ 40 locus SSR ở ựậu tương cùng với 118 chỉ thị RFLP và RAPD. 18 trong 29 nhóm liên kết chứa ắt nhất một locus SSR ựược phân bố khá ngẫu nhiên trong hệ gen ựậu tương. Năm 1995, Maughan nghiên cứu trên 94 giống ựậu tương ựã xác ựịnh ựược 79 alen trên 5 locus [33]. Năm 1997, với 20 chỉ thị SSR, Diwan và Cregan ựã xác ựịnh ựược trung bình là 10 alen trên mỗi locus [20]. Navel và CS (2000) khi nghiên cứu 40 giống ựậu tương trong tập ựoàn ựậu tương và 39 giống cao sản ựã sử dụng 74 chỉ thị SSR và nhận ựược 379 alen trên 74 locus, trong ựó có 138 alen ựặc hiệu cho các giống trong tập ựoàn tại 60 locus, còn 32 alen ựặc hiệu cho các
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 19
giống cao sản tại 27 locus SSR [35]. Abe và cs (2003) ựã phân tắch 20 locus SSR trên 131 giống ựậu tương từ 14 nước Châu Á và nhận thấy rằng trung bình trên mỗi locus SSR có ựến 11,2 alen [16]. Họ cũng ựã nhận ra sự khác nhau về nguồn gốc di truyền giữa tập ựoàn giống ựậu tương ở Nhật Bản và Trung Quốc. Một phát hiện khác của nhóm nghiên cứu này ựã chỉ ra rằng các giống của các nước đông Nam Á và Trung Á phần lớn bắt nguồn từ Trung Quốc. Mức ựa hình cao, bản chất locus riêng lẻ và phân bố ngẫu nhiên trong hệ gen ựậu tương ựã ựưa ựến một kết luận là các chỉ thị SSR có thể cung cấp sự hỗ trợ tuyệt vời cho các chỉ thị RFLP trong nghiên cứu sinh học phân tử, di truyền học và lai chọn giống cây trồng.
Trong chọn giống cây trồng, kỹ thuật SSR ựược sử dụng ựể phân tắch và chọn lọc những tắnh trạng quý dùng cho lai tạo và chọn giống. Bên cạnh những gen quy ựịnh tắnh trạng, những trình tự lặp lại cũng có vị trắ trong cùng một nhóm gen liên kết ựến tắnh trạng này. Cregan và cs (1999) [19] ựã sử dụng ựồng thời các chỉ thị SSR, RAPD, RFLPẦvà thiết lập ựược bản ựồ gen với 20 nhóm gen liên kết ở ựậu tương trên cơ sở ba quần thể lai của các trường ựại học Iowa, Utah và Nebraska. Specht và CS (2001) ựã phân tắch QTL của tắnh chịu hạn ở ựậu tương trên cơ sở thắ nghiệm chế ựộ tưới nước khác nhau, kiểm tra sự chuyển hoá cacbon và cuối cùng ựánh giá năng suất, khối lượng và phẩm chất hạt. Họ sử dụng 665 chỉ thị phân tử bao gồm RFLP, SSR ựể nghiên cứu tổ hợp lai bao gồm 265 dòng lai trên 20 nhóm gen liên kết. Các tác giả cũng ựã tìm thấy các chỉ thị phân tử SSR và RFLP có QTL biểu thị rõ nhất ựối với tắnh chịu hạn [42].
Nghiên cứu ựa dạng sinh học của các giống ựậu tương ựịa phương Việt Nam ựược nhóm tác giả Viện Công nghệ sinh học và Trung tâm Nghiên cứu và phát triển đậu ựỗ thực hiện ựể phục vụ cho mục ựắch lai tạo giống mới. Một trong những nghiên cứu ựầu tiên về SSR tại Việt Nam là của Trần Thị Phương Liên, Lê Thị Muội (2003) nghiên cứu về sự ựa dạng di truyền của một số giống ựậu tương bằng chỉ thị phân tử
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 20
SSR [9], ựược thực hiện trên 7 kiểu gen ựậu tương của Việt Nam. Cũng trên ựối tượng ựậu tương, Trần Thị Phương Liên và cs (2009) ựã ựánh giá khả năng kháng bênh gỉ sắt trên 40 giống ựã phát hiện 4 giống kháng mới, 11 giống trung gian nhiễm ựược tìm thấy ở tắnh Cao Bằng và Tây Nguyên [43]. Về bệnh rỉ sắt trên cây ựậu tương còn có nghiên cứu của Lê Thị Ngọc Vi và Nguyễn Thị Lang (2006) ựã nghiên cứu gen kháng bệnh rỉ sắt trên ựậu nành bằng phương pháp phân tử Microsatellite [15] Ngoài ra, kĩ thuật SSR còn ựược sử dụng ựể nghiên cứu ựa dạng trên các ựối tượng khác và bước ựầu ựã mang lại một số kết quả nhất ựịnh. Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2008) ựã sử dụng kỹ thuật SSR ựể nghiên cứu tắnh ựa dạng di truyền của một số giống ựậu xanh chịu hạn khác nhau [12]. Nguyễn Thị Minh Nguyệt và cs (2009) ựã sử dụng SSR ựể xác ựịnh các chỉ thị phân tử liên kết gen kháng bệnh xanh lùn ở cây bông cỏ [11]. Khuất Hữu Trung (2010) ựã sử dụng kỹ thuật SSR ựể nghiên cứu ựa dạng di truyền tập ựoàn nhãn bản ựịa Việt Nam [14]. Vũ Thị Thu Hiền, Phạm Văn Cường (2012) ựã sử dụng 34 chỉ thị phân tử SSR phân tắch ựa dạng di truyền của 64 dòng/ giống lúa ựang canh tác trong ựiều kiện nhờ nước trời [5]. Tuy nhiên hiện nay, chưa có nhiều những nghiên cứu về bệnh phấn trắng trên cây ựậu tương, cũng như khả năng kháng bệnh phấn trắng trên các giống ựậu tương trong tập ựoàn giống tại Việt Nam.
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 21
Chương 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1.Vật liệu
3.1.1. Vật liệu thực vật và nấm bệnh
Vật liệu thực vật: các giống ựậu tương thu thập ở các ựịa phương trên toàn quốc và các giống nhập nội ựược Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển đậu ựỗ Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp và khảo sát sơ bộ về ựặc tắnh nông sinh học ựược sử dụng làm vật liệu nghiên cứu.
Bảng 3.1. Danh sách các giống ựậu tương nghiên cứu
TT Kắ hiệu Nguồn gốc Thời gian sinh trưởng Màu hoa Màu hạt Năng suất Khả năng kháng bệnh phấn trắng tự nhiên
1 D1 Việt nam 90 Trắng Vàng Cao Kháng
2 D2 Mỹ 105 Trắng Vàng Trung bình Kháng cao
3 D3 Thái Lan 105 Tắm Vàng Cao Nhiễm
4 D4 Mỹ 105 Tắm Vàng Cao Nhiễm trung bình
5 D5 Úc 105 Tắm Vàng Cao Kháng
6 D6 Mỹ 105 Tắm Vàng Cao Kháng cao
7 D7 Việt Nam 110 Tắm Vàng Thấp Nhiễm rất nặng 8 D8 Việt nam 90 Tắm Vàng Thấp Nhiễm nặng 9 D9 Việt nam 95 Trắng Vàng Cao Nhiễm rất nặng 10 D10 Úc 98 Trắng Vàng Cao Nhiễm trung bình 11 D11 Việt nam 88 Tắm Vàng Cao Nhiễm trung bình 12 D12 Việt nam 93 Tắm Vàng Thấp Nhiễm trung bình 13 D13 Việt nam 94 Tắm Vàng Thấp Nhiễm nặng 14 D14 đài Loan 113 Tắm Vàng Cao Kháng cao 15 D15 Trung quốc 90 Tắm Vàng Cao Kháng 16 D16 Trung quốc 90 Tắm Vàng Trung bình Nhiễm rất nặng
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 22
17 D17 Việt nam 90 Tắm Vàng Cao Kháng cao 18 D18 Trung Quốc 78 Trắng Vàng Cao Nhiễm trung bình 19 D19 Việt nam 84 Tắm Vàng Thấp Nhiễm rất nặng 20 D20 Việt nam 90 Tắm Vàng Thấp Nhiễm trung bình 21 D21 Trung quốc 75 Trắng Vàng Cao Kháng 22 D22 Việt nam 80 Trắng Vàng Thấp Nhiễm rất nặng 23 D23 Trung Quốc 85 Tắm Vàng Trung bình Nhiễm trung bình 24 D24 Việt nam 103 Tắm Vàng Thấp Nhiễm trung bình 25 D25 Việt nam 95 Tắm Vàng Trung bình Nhiễm rất nặng 26 D26 Việt nam 94 Tắm Vàng Thấp Kháng cao 27 D27 đài loan 88 Tắm Vàng Trung bình Kháng cao 28 D28 Việt nam 100 Tắm Vàng Thấp Nhiễm nặng 29 D29 Việt nam 120 Tắm Vàng Cao Nhiễm rất nặng 30 D30 Việt nam 104 Tắm Vàng Thấp Nhiễm nặng 31 D31 Việt nam 99 Tắm Vàng Cao Nhiễm rất nặng 32 D32 Việt nam 105 Tắm Vàng Thấp Nhiễm nặng 33 D33 Việt nam 105 Tắm Vàng Trung bình Nhiễm nặng 34 D34 Việt nam 113 Tắm Vàng Thấp Nhiễm rất nặng
Nguồn bệnh phấn trắng: nguồn bệnh ựể lây nhiễm là bào tử của lá nhiễm bệnh ựược thu thập ngoài ựồng ruộng và nguồn nhiễm bệnh ựược chuẩn bị sẵn trong nhà lưới. Lá bệnh có thể thu ở ngoài ựồng vào bất kì thời gian nào trong ngày.
Nguyên tắc thu thập lá bệnh: chọn lá còn xanh, bị bệnh trên 50% diện tắch lá, có ắt bào tử; rửa lá sạch nhưng nhẹ nhàng ựể tránh làm rách lá và hong trên rổ hoặc sàng cho ựến khi ráo nước nhưng mặt lá vẫn còn ẩm; cho lá vào trong túi ni-lông hoặc giấy xi măng, ựặt vào chỗ tối với khoảng thời gian 12 giờ ở nhiệt ựộ tối thắch là 20 - 25oC ựể kắch thắch quá trình sinh bào tử. Nếu nhiệt ựộ thấp hơn hoặc cao
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 23
hơn, bào tử hình thành ắt. Nếu lá bệnh chưa sử dụng ngay có thể ựể ựến 48 giờ nhưng cần giữ ẩm tốt ựể lá không bị héo và bào tử không bị già ựi.
3.1.2. Hoá chất
Acrylamide, bis acrylamide, Tris, EDTA (Ethylendiamine tetra acetic acid), glycin, CTAB (Cetylmethylammonium bromide), Taq DNA polymerase (hãng Bio - Lad), βmecaptoethanol, phenol, chloroform: isoamyl alcohol (24:1), Natriaxetat, ethanol (70%, 100%), ARNase, dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), agarose, ethidium bromide (EtBr)Ầ và các hoá chất khác ựược mua của các hãng Merck, Invitrogen, Amersham Pharmacia Biotech, New England Biolabs.
3.1.3. Máy móc và thiết bị
- Máy quang phổ UVvis Cintra 40 (Australia)
- Bộ nguồn ựiện di PowerPac 300 (Bio-Rad, Hoa Kỳ) - Máy PCR PTC - 100TM (MJ Research, Hoa Kỳ) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Máy soi DNA (Mini - transllumminator. Bio-Rad, Hoa Kỳ) - Máy li tâm lạnh Hittich (đức)
- Máy li tâm Avanti TM30 (Backman, Hoa Kỳ) - Máy ly tâm Eppendorf 5415C (Eppendorf, đức) - Máy khuấy trộn (Voltex) (Minishaker, IKA, đức), - Máy hút chân không SpeedVac 110A (Savant, Hoa Kỳ)
- Lò vi sóng (SamSung, Hàn Quốc), tủ sấy của hãng Carbolite (Anh), tủ lạnh -200 (Sanyo, Nhật Bản), pipetman, giá ựổ ựiện di, cối chày sứ, bể ổn nhiệt, nồi khử trùngẦ
3.1.4. Mồi của phản ứng SSR
Trong ựề tài này chúng tôi ựã sử dụng các mồi ựược ựặt tổng hợp tại hãng Invitrogen và trình bày trong bảng sau:
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 24
Bảng 3.2. Tên 15 mồi sử dụng cho phản ứng SSR-PCR
TT Tên Mồi
Trình tự mồi xuôi (F) và mồi ngược (R) Từ ựầu 5Ỗ ựến 3Ỗ Nhóm liên kết Kắch thước alen 1 Satt364 F - GCGGCATAAGTTTTCATCCCATC R - ATCGGGTCATGACTTTTGAAGA A1 229 2 Satt449 F - GCGTGCTTCTTATATTAGGTGTTAGT R - GCGCATTGGAGTTTTTGCTTTT A1 265 3 Sat_182 F - GCGATATTACCAGGATTGTCTGTGTC R - GCGTAGGCACACTTCGTTGTTTACT B2 202 4 Satt412 F - TCGGGACAGGTGAAATCTGAAATA R - TTCCTTTTAATTCTAACATTGAG D1b 302 5 Sat_298 F - GCGCGTCGAAGCAAAAATTAAA R - GCGGCGAAACCCACAAAGCATA F 282 6 Satt622 F - GCGGTGTAGGTAATAATTTTAATTCTCAT R - GCGGTGTAGGTTTCACACTTCATTCAC J 236 7 Satt596 F- TCCCTTCGTCCACCAAAT R - CCGTCGATTCCGTACAA J 252 8 Sat_259 F - TGGGCCATTTGGGCAGCTCGACT R - ATTCACACGCATCTGGAATAATA J 302 9 Satt456 F - GGGCCTTCGTTTGAGTTCATAG R - GGGATCATTGGTTAATTGTTGTAAG J 288 10 Satt547 F - GCGCTATCCGATCCATATGTG R - TGATTTCGCTAGGTAAAATCA J 209 11 Satt370 F - GCGGTTAAGGGAATTTGTAACTTGAA R - GCGATCATGCATTTATTTGAGATA J 299
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 25 12 Satt183 F - TAGGTCCCAGAATTTCATTG R - CACCAACCAGCACAAAA J 240 13 Satt654 F - AGACGCGCACACAAGCATATA R - GCTGGGACTCCTCATGTC J 156 14 Sat_228 F- GCGTGACTACGGGAAGTTGGAAC R - GCGTTGGCGGTAAGAGCACTATA J 252 15 Satt529 F - GCGCATTAAGGCATAAAAAAGGATA R - GCACAATGACAATCACATACA J 210
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Phương pháp nhiễm bệnh nhân tạo trong khu cách biệt
Thắ nghiệm ựược bố trắ theo phương pháp khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh (RCBD- Randomized Complete Block Design) với ba lần nhắc lại trong khu cách biệt ựể ựánh giá khả năng kháng bệnh.
Phương pháp lây nhiễm, ựánh giá bệnh phấn trắng theo phương pháp của Yorinori (1997) [47].
Do nấm phấn trắng là ký sinh chuyên tắnh, chưa có phương pháp nuôi cấy trong ựiều kiện phòng thắ nghiệm hữu hiệu nên chúng tôi tiến hành lây nhiễm nhân tạo từ nguồn bệnh phấn trắng ngoài tự nhiên. So với ngoài ựồng, nhiễm bệnh trong nhà lưới có nhiều ưu ựiểm như dễ tạo ựiều kiện thuận lợi ựể bệnh phát triển mạnh. Trình tự nhiễm bệnh ựược tiến hành như sau:
- Các giống ựậu tương ựược gieo trong nhà lưới trên cùng một nền ựất và ựược chăm sóc với cùng một ựiều kiện. Khi cây có một lá kép ựã mở hoàn toàn, việc lây nhiễm mới ựược thực hiện.
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 26
- Dịch vẩn bào tử với mật ựộ 5 x 104 bào tử/ml ựược ựưa ựều lên hai mặt lá bằng bình phun với lượng phun 0,5 ml/dm2 lá.
độ ẩm bão hoà ựược tạo ra trong thời gian 24 giờ bằng cách chụp túi nylon lên cây. Trước ựó, cây ựược tưới ựẫm nước, ựồng thời mặt trong của túi cũng ựược phun nước lên. Sau khi lây nhiễm cây ựược ựể tối trong 12 giờ và ựược giữ ở chỗ mát, không có ánh sáng trực tiếp. Sau ựó, các cây ựược ựể trong ựiều kiện phát triển bình thường, hoặc ựược che nắng (trong thời kì tiềm dục) và tưới nước thường xuyên ựể tạo ựộ ẩm cao.
Sau 3 tuần lây nhiễm, việc tiến hành ựánh giá ựặc ựiểm của vết bệnh, mức ựộ tạo quầng và mức ựộ hình thành bào tử theo phương pháp của Yorinori (1997).
Bảng 3.3. Thang ựiểm nhiễm bệnh của ựậu tương
Thang ựiểm
nhiễm bệnh Mức ựộ hại (%) đánh giá
0 Không bị bệnh; không hình thành bào tử Kháng rất cao(miễn dịch)
1 có 1-10% vết bệnh có bào tử trên tổng số vết
bệnh trong 1 ựơn vị diện tắch lá bị nhiễm bệnh. Kháng cao
2 có 11-25% vết bệnh có bào tử trên tổng số vết
bệnh trong 1 ựơn vị diện tắch lá bị nhiễm bệnh. Kháng
3 có 26-50 % vết bệnh có bào tử trên tổng số vết
bệnh trong 1 ựơn vị diện tắch lá bị nhiễm bệnh. Nhiễm trung bình (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4 có 51-75% vết bệnh có bào tử trên tổng số vết
bệnh trong 1 ựơn vị diện tắch lá bị nhiễm bệnh. Nhiễm nặng
5 có trên 75% vết bệnh có bào tử trên tổng số vết
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 27
3.2.2. Phương pháp tách chiết và ựo nồng ựộ DNA tổng số 3.2.2.1.Phương pháp tách chiết DNA tổng số 3.2.2.1.Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Tách chiết DNA tổng số theo phương pháp của Gawel và Jarret (1991) [21] có cải tiến nhỏ.
Nghiền 0,2 gam mẫu lá trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ. Bột ựã nghiền cho vào ống eppendorf 2ml.Bổ sung 1ml ựệm rửa (Tris-HCl 1M pH 8, EDTA 0,5M pH 8, Sorbitol 0,35M, Na2HPO4 0,4 %), lắc mạnh trong 40 giây, sau ựó ly tâm(12000 vòng/phút, 4oC, 12 phút), loại dịch nổi và lặp lại bước này từ 1-2 lần.
Sau ựó, bổ sung 800ộl ựệm chiết (Tris HCl 0,1M pH 8; EDTA 0,5M pH 8; NaCl 6M; β - Mecaptoethanol 0,14M; CTAB 4%) ủ 65oC trong 90 phút ựể chiết DNA.
Giữ mẫu ở nhiệt ựộ phòng trong thời gian 10 phút. Thêm 0,8ml dung dịch Chloroform/ Isoamyl alcohol (24:1), lắc ống nhẹ nhàng 15 phút. Sau ựó, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC (tùy từng loại mẫu, làm sao cho phần cặn lắng xuống).
Dùng pipet hút lớp trên cùng sang ống eppendorf 2ml mới. Bổ sung một thể tắch tương ựương Isopropanol(lạnh) và ựảo nhẹ, giữ mẫu trong ựá 30 phút, sau ựó ly tâm 12000 vòng/phút trong thời gian 10-15 phút ở 4oC.
Loại dịch nổi, rửa tủa AND bằng cách thêm 500ộl cồn 70%, ly tâm 12000 vòng/phút trong thời gian 4 phút ở 4oC, lặp lại bước này 2 lần. Sau ựó nhẹ nhàng loại bỏ dịch nổi chỉ giữ lại tủa DNA.
Làm khô DNA bằng quạt gió, máy hút chân không, bổ sung 50-100ộl nước deion có cho thêm ARNase. điện di kiểm tra DNA tổng số trên gel agaronhor0,8% và ựo OD.
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 28
3.2.2.2.Phương pháp ựo OD bằng máy Nano Drop
DNA sau khi tách chiết sẽ ựược ựo nồng ựộ OD trên máy ựo quang phổ