3.2.2.1.Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Tách chiết DNA tổng số theo phương pháp của Gawel và Jarret (1991) [21] có cải tiến nhỏ.
Nghiền 0,2 gam mẫu lá trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ. Bột ựã nghiền cho vào ống eppendorf 2ml.Bổ sung 1ml ựệm rửa (Tris-HCl 1M pH 8, EDTA 0,5M pH 8, Sorbitol 0,35M, Na2HPO4 0,4 %), lắc mạnh trong 40 giây, sau ựó ly tâm(12000 vòng/phút, 4oC, 12 phút), loại dịch nổi và lặp lại bước này từ 1-2 lần.
Sau ựó, bổ sung 800ộl ựệm chiết (Tris HCl 0,1M pH 8; EDTA 0,5M pH 8; NaCl 6M; β - Mecaptoethanol 0,14M; CTAB 4%) ủ 65oC trong 90 phút ựể chiết DNA.
Giữ mẫu ở nhiệt ựộ phòng trong thời gian 10 phút. Thêm 0,8ml dung dịch Chloroform/ Isoamyl alcohol (24:1), lắc ống nhẹ nhàng 15 phút. Sau ựó, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC (tùy từng loại mẫu, làm sao cho phần cặn lắng xuống).
Dùng pipet hút lớp trên cùng sang ống eppendorf 2ml mới. Bổ sung một thể tắch tương ựương Isopropanol(lạnh) và ựảo nhẹ, giữ mẫu trong ựá 30 phút, sau ựó ly tâm 12000 vòng/phút trong thời gian 10-15 phút ở 4oC.
Loại dịch nổi, rửa tủa AND bằng cách thêm 500ộl cồn 70%, ly tâm 12000 vòng/phút trong thời gian 4 phút ở 4oC, lặp lại bước này 2 lần. Sau ựó nhẹ nhàng loại bỏ dịch nổi chỉ giữ lại tủa DNA.
Làm khô DNA bằng quạt gió, máy hút chân không, bổ sung 50-100ộl nước deion có cho thêm ARNase. điện di kiểm tra DNA tổng số trên gel agaronhor0,8% và ựo OD.
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 28
3.2.2.2.Phương pháp ựo OD bằng máy Nano Drop
DNA sau khi tách chiết sẽ ựược ựo nồng ựộ OD trên máy ựo quang phổ Nano Drop.
Dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng ở bước sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine, sẽ ựo ựược giá trị mật ựộ quang ở bước sóng 260 nm (OD260nm -
Optical Density 260 nm) của các mẫu và cho phép xác ựịnh nồng ựộ DNA trong mẫu. để kiểm tra ựộ sạch của dung dịch, dung dịch DNA ở bước sóng 280 nm (OD280nm) sẽ ựược ựo. Ở bước sóng 280 nm, các protein có mức hấp thụ cao nhất, nhưng các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm như các axit nucleic và do ựó làm sai lệch giá trị thật của nồng ựộ axit nucleic. Một dung dịch axit nucleic ựược xem là sạch (không tạp nhiễm protein) khi tỉ số OD260nm/ OD280nm nằm trong khoảng 1,8 - 2,0.
3.2.3. Phương pháp PCR-SSR
PCR với các mồi SSR ựược thực hiện theo phương pháp của Sambrook và Russell [39] với tổng thể tắch là 25ộl/mẫu gồm những thành phần ựược trình bày ở bảng 3.4
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 29 Bảng 3.4. Thành phần phản ứng SSR -PCR STT Thành phần Thể tắch (ộộộộl) 1 dH20 13,8ộl 2 Buffer 10x 2,5ộl 3 dNTP (25mM) 2,5ộl 4 Mg2+(2,5mM) 2ộl 5 Mồi xuôi (10pM) 1ộl 6 Mồi ngược (10pM) 1ộl
7 Enzyme Taq polymerase (5 Ui/ộl) 0,2ộl 8 DNA tổng số (50ng/ộl) 2ộl
Tổng 25ộl
Trộn ựều các thành phần của hỗn hợp rồi chuyển vào máy PCR sau ựó chạy theo chương trình sau:
1. 94oC trong 3 phút 5. Lặp lại 35 chu kỳ từ bước 2 ựến bước 4
2. 94oC trong 45 giây 6. 72oC trong 10 phút
3. Ta trong 45 giây 7. Giữ nhiệt ựộ 4oC trong 30 phút
4. 72oC trong 45 giây
3.2.4. Phương pháp ựiện di DNA Nguyên tắc chung Nguyên tắc chung
điện di là một kỹ thuật dùng ựể tách và ựịnh lượng axit nucleic với các kắch thước và hàm lượng khác nhau. Kỹ thuật này dựa trên một ựặc tắnh cơ bản của axit nucleic là các ựại phân tử tắch ựiện âm. Do ựó khi ựặt axit nucleic trong ựiện trường với cường ựộ dòng và hiệu ựiện thế thắch hợp, chúng sẽ dịch chuyển dần về phắa cực dương.
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 30
3.2.4.1.điện di DNA trên gel agarose
điện di DNA trên gel agarose ựược tiến hành theo phương pháp của Sambrook và Russell [39]
Gel ựược sử dụng trong kỹ thuật này là gel agarose, nồng ựộ thường từ 0,8% Ờ 1,5% nhưng tùy thuộc vào kắch thước trung bình của ựoạn DNA cần phân tách mà sử dụng nồng ựộ gel agarose cho thắch hợp.
- Chuẩn bị gel agarose: Cho agarose vào dung dịch ựệm TAE( vắ dụ với gel 0,8% thì cân 0,8 g agarose vào 100 ml dung dịch ựệm TAE). đun trong lò vi sóng cho ựến khi thu ựược dịch trong suốt. để nguội ựến khoảng 50 Ờ 60oC, ựổ dung dich agarose vào khay ựã cài sẵn răng lược. Sau một thời gian gel ựông lại thì rút răng lược ra và ựặt bản gel vào bể ựiện di có chứa dung dịch ựệm TAE.
- Tra mẫu DNA: Trộn một lượng mẫu thắch hợp với ựệm tra mẫu, tra vào ỘgiếngỢ trên bản gel. điện di với dòng ựiện một chiều có hiệu ựiện thế 100V, dòng ựiện 60 - 80 mA trong khoảng 30 phút.
- Sau khi kết thúc ựiện di, lấy bản gel ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr có nồng ựộ 0,5 ộl/ml. Lấy bản gel ra sau 10 - 15 phút và rửa trong nước sạch.
- Quan sát và chụp ảnh trên máy Bio-rad.
3.2.4.2.điện di DNA trên gel polyacrylamide
điện di DNA trên gel polyacrylamide ựược tiến hành theo phương pháp của Sambrook và Russell [39] có cải tiến nhỏ.
Chuẩn bị gel chạy ựiện di
Gel ựiện di bao gồm 80ml polyacrylamide 6%, bổ sung thêm 80ộl TEMED, và 400ộl APS 10%.
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 31 Bảng 3.5. Thành phần gel polyacrylamide 6% Tên Nồng ựộ gốc Nồng ựộ sử dụng Thể tắch lấy Polyacrylamid 30% 6% 100ml Ure 420g/l 420g/l 210g TAE 50X 1X 10ml Dẫn H20 lên thể tắch 500ml
Chuẩn bị dung dịch nhuộm
Dung dịch cố ựịnh (1 lắt), bao gồm 100ml CH3COOH, thêm nước cất cho ựủ một lắt, dung dịch này dùng ựược 2 lần.
Dung dịch hiện (1 lắt), bao gồm 30gam sodium cacbonat, thêm vào 1,5ml HCHO, 0,4ml Na2S2O3 và thêm nước cất cho ựủ 1 lắt. đưa vào tủ lạnh, dung dịch hiện chỉ dùng ựược một lần và chỉ phát huy tác dụng ựược giữ lạnh.
Dung dịch nhuộm (1 lắt), bao gồm 1gam AgNO3, 1,5ml HCHO, thêm nước cất vừa ựủ 1 lắt, dung dịch dùng ựược 2 lần.
Tiến hành nhuộm bản gel
Gel sau khi ựược ựiện di ở công suất 30W trong 1-2 giờ, ựược ựưa vào dung dịch cố ựịnh ựặt lên máy lắc trong 30 phút, ựến khi không còn thấy các vạch nhuộm màu nữa.
Rửa bản gel 2 lần bằng nước cất, mỗi lần 3 phút.
Nhuộm gel bằng dung dịch nhuộm ắt nhất trong 30 phút trên máy lắc. Rửa bản gel ựã nhuộm thật nhanh bằng nước cất, rửa trong không quá 10 giây. Cho bản gel ựã rửa vào dung dịch hiện ựã ựược làm lạnh ở 10oC. đặt lên máy lắc từ 5-10 phút, cho ựến khi thấy nổi rõ các băng ựiện di.
Cố ựịnh gel bằng dung dịch cố ựịnh trong 3-5 phút, kết thúc phản ứng nhuộm. Rửa lại bản gel bằng nước cất và ựể khô ở nhiệt ựộ phòng.
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 32
3.2.5. Phương pháp phân tắch số liệu
Xử lý kết quả phân tắch SSR theo Nei (1987) [36].
Dựa vào ảnh ựiện di sản phẩm PCR và sự xuất hiện các băng SSR của các giống ựậu tương ựối với các mồi ựể làm cơ sở cho việc phân tắch số liệu.
Phân tắch số liệu theo quy ước: - Số 1 - xuất hiện băng SSR.
- Số 0 - không xuất hiện băng SSR. Các số liệu này ựược nhập vào phần mềm Excel theo từng mồi.
Hệ số ựa dạng di truyền H cho mỗi chỉ thị phân tử ựược tắnh theo công thức: H = 1 - ∑ Pi2
Trong ựó Pi là tần suất lặp alen thứ i của mỗi chỉ thị phân tử.
Lập cây phân loại: Số liệu ựược ựưa vào phần mềm chuyên dụng NTSYS pc version 2.0 ựể tìm ra sự sai khác giữa các giống ựậu tương thông qua biểu ựồ cây ở hệ số tương ựồng Jaccard. Phân tắch và ựánh giá hệ số tương quan kiểu hình theo phương pháp phân nhóm UPGMA.
Sau ựó sử dụng phần mềm NTYSYS 2.1x ựể lập biểu ựồ phân nhóm 2 chiều dựa trên phân tắch PCA (principal Coordinate analysis) qua ựó sẽ lập thêm phân nhóm dựa trên khoảng cách di truyền giữa các dòng, giống ựậu tương nghiên cứu.
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 33
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1.Kết quả ựánh giá ựa dạng di truyền của 34 giống ựậu tương
4.1.1. Kết quả tách DNA tổng số
Các mẫu lá của 34 giống ựậu tương ựược rửa sạch và tách DNA. để hạn chế sự phân hủy DNA, việc tách chiết DNA ựược tiến hành trong ựiều kiện nhiệt ựộ thấp nhằm ức chế sự hoạt ựộng của các enzyme này. Do vậy, trước khi nghiền mẫu, cối và chày sứ ựược giữ trong tủ lạnh -80oC. Mẫu sau ựó ựược tiến hành nghiền trong nitơ lỏng. Sau khi nghiền thành dạng bột mịn, mẫu ựược hòa tan trong dung dịch ựệm chiết. Hỗn hợp dung dịch ựệm này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, ựồng thời giải phóng DNA ra môi trường. Thành phần CTAB trong ựệm chiết không những có tác dụng phá vỡ tế bào mà còn có vai trò ức chế sự hoạt ựộng của các nuclease. Trong khi ựó, EDTA lại có tác dụng cố ựịnh các ion Mg2+ (là yếu tố cần thiết cho sự hoạt ựộng của các nuclease), nên sẽ ngăn không cho các nuclease phân giải DNA trong quá trình tách chiết.
để loại bỏ protein trong hỗn hợp, mẫu ựược bổ sung hỗn hợp: chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1). Chloroform làm biến tắnh protein nhưng không làm ảnh hưởng ựến cấu trúc của DNA, ựồng thời nó còn tạo ựiều kiện thuận lợi cho việc tách pha nước với pha hữu cơ. Isoamyl alcohol có tác dụng làm giảm bọt khắ trong quá trình tách chiết. Sau khi lắc mạnh và ựem ly tâm, hỗn hợp ựược phân làm 3 pha: pha trên cùng là pha nước có chứa DNA, pha giữa là protein ựã bị biến tắnh, pha dưới cùng là hỗn hợp chloroform và isoamyl alcohol. Pha nước ựược hút nhẹ nhàng sang ống mới.
Tiếp theo là bước kết tủa DNA bằng cồn tuyệt ựối, cồn có tác dụng hút lớp nước bao quanh phân tử DNA ựể lộ ra các gốc phosphate tắch ựiện âm. Khi ựó các ion Na+ kết hợp với các gốc phosphate này khiến cho lực ựẩy giữa các chuỗi nucleotide giảm, do ựó DNA bị kết tủa. Ở ựiều kiện -20oC trong 15 giờ thì DNA
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 34
kết tủa gần như hoàn toàn. Trong dung dịch này có lẫn nhiều RNA, vì thế chúng tôi ựã tiến hành loại RNA bằng cách ủ dung dịch với RNase 0,01mg/ml ở 37oC trong 2 - 3 giờ. DNA tổng số sau ựó ựược ựiện di trên gel agarose 0,8% ựể kiểm tra chất lượng và nồng ựộ.
Do có cấu trúc dạng mạng lưới, nên sau khi ựiện di các ựoạn DNA có kắch thước và trọng lượng khác nhau sẽ di chuyển với tốc ựộ khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc và trọng lượng phân tử của chúng. DNA tổng số có kắch thước và trọng lượng phân tử lớn nhất nên dưới tác dụng của dòng ựiện một chiều, DNA tổng số sẽ di chuyển chậm và chiếm vị trắ cao nhất trên bản gel. Những ựoạn DNA có kắch thước nhỏ hơn (do bị phân hủy) và các phân tử RNA chạy nhanh hơn tạo thành vệt sáng phắa dưới vạch DNA tổng số.
Hình 4.1. Hình ảnh ựiện di DNA tổng số của các giống ựậu tương
Giếng 1-16: giống theo thứ tự D1-D16
Trong cấu trúc của phân tử DNA có các liên kết hydro giữa 2 mạch ựơn nên trong quá trình nhuộm, các phân tử EtBr sẽ bám vào các liên kết này. Phân tử EtBr có khả năng phát quang dưới ánh sáng của tia tử ngoại (UV), nên ta có thể phát hiện ựược các băng vạch khi chiếu bản gel dưới ánh sáng UV. Sau khi nhuộm bản gel trong dung dịch EtBr 15 phút, các băng DNA ựã xuất hiện rõ nét dưới ánh sáng tử ngoại. Kết quả tách chiết DNA các giống ựậu tương ựược thể hiện trên hình 4.1.
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 35
Trên hình, các băng diện di DNA tổng số cho kết quả gọn, rõ nét, chứng tỏ DNA có ựộ nguyên vẹn cao, không bị lẫn tạp chất. DNA ựược ựo OD ựể kiểm tra chất lượng DNA cũng như nồng ựộ của chúng và pha loãng ựến nồng ựộ thắch hợp ựể tiến hành các thắ nghiệm tiếp theo.
Bảng 4.1. Hàm lượng và ựộ tinh sạch DNA của 34 giống ựậu tương nghiên cứu
STT Tên giống OD260/280 Hàm Lượng (ng/ộl) STT Tên giống OD260/280 Hàm Lượng (ng/ộl) 1 D1 1,83 179,1 18 D18 1,89 204,7 2 D2 1,80 342,6 19 D19 1,85 253,1 3 D3 1,89 310,2 20 D20 1,85 137,5 4 D4 1,88 440,4 21 D21 1,81 111,5 5 D5 1,86 210,1 22 D22 1,88 262,2 6 D6 1,86 182,2 23 D23 1,87 403,2 7 D7 1,83 376,6 24 D24 1,84 330,0 8 D8 1,81 490,2 25 D25 1,88 601,9 9 D9 1,80 405,1 26 D26 1,85 431,2 10 D10 1,83 297,5 27 D27 1,83 738,4 11 D11 1,83 589,8 28 D28 1,88 432,4 12 D12 1,84 556,0 29 D29 1,88 255,7 13 D13 1,86 262,6 30 D30 1,90 561,7 14 D14 1,85 373,7 31 D31 1,83 433,5 15 D15 1,87 390,9 32 D32 1,90 716,4 16 D16 1,83 646,6 33 D33 1,91 617,8 17 D17 1,84 199,6 34 D34 1,88 411,7
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 36
Sau khi kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp quang phổ hấp thụ, chúng tôi ựã xác ựịnh ựược hàm lượng DNA tách chiết từ các giống ựậu tương, kết quả ựã ựược thể hiện qua bảng 4.1. Phổ hấp thụ DNA của các giống ựậu tương có tỷ số A206/A280 dao ựộng trong khoảng 1,81 - 1,91. Các mẫu DNA tổng số ựược tách từ lá của các giống ựậu tương có hàm lượng cao dao ựộng từ 111,5 Ờ 738,4 ng/ộl. Kết quả tách chiết DNA tốt, DNA ựược pha loãng ra nồng ựộ 50ng/ộl ựể tiến hành phản ứng PCR - SSR
4.1.2. Kết quả PCR- SSR trên ựiện di polyacrylamide
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 15 cặp mồi SSR (Bảng 3.2) trong phản ứng PCR - SSR ựể nhân bản các phân ựoạn DNA từ hệ gen của 34 giống ựậu tương. Sản phầm PCR - SSR ựược kiểm tra trên gel agarose 1,5%. Sau ựó, các phân ựoạn PCR - SSR ựược phân tách trên ựiện di polyacrylamide 6% và nhuộm bạc. Trong số 15 chỉ thị SSR sử dụng ựể phân tắch sự ựa dạng di truyền của 34 giống ựậu tương thì tất cả 15 chỉ thị SSR ựều cho tắnh ựa hình.
Kết quả phân tắch hình ảnh ựiện di sản phẩm SSR của 15 cặp mồi ựược trình bày trên hình 4.2. Ở tất cả 34 giống ựậu tương ựược nghiên cứu, các băng PCR nhân lên ựặc hiệu cho từng chỉ thị phân tử SSR và có kắch thước của ựoạn SSR gần với kắch thước tương ứng của từng chỉ thị SSR. Thống kê các phân ựoạn DNA ựược nhân bản, chúng tôi ựã phát hiện ựược 61 alen, số alen ựa hình của mỗi chỉ thị SSR biến ựộng từ 2 ựến 7 và ựạt trung bình là 4 alen (bảng 4.2).
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 37
Hình 4.2. Phổ ựiện di sản phẩm PCR của một số cặp mồi SSR
M: Marker 100bp
Giếng 1-34: các giống ựậu tương D1-D34
Trên cơ sở phân tắch kết quả thống kê các alen, chỉ số ựa dạng di truyền của từng chỉ thị SSR ựã ựược thể hiện qua bảng 4.2 cho thấy 2 chỉ thị Sat_182, Sat_298 cho sự ựa dạng cao nhất là 7 alen và các chỉ thị cho sự ựa dạng thấp nhất là 2 alen cho mỗi chỉ thị phân tử như Satt364 và Satt622. Sử dụng các chị thị SSR nghiên cứu tắnh ựa dạng trên thế giới thường ựạt từ 5 ựến 11 allen cho mỗi chỉ chị [16] [35].