4. Ý nghĩa của đề tài
2.2.2. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền bằng kỹ thuật PCR – RAPD
2.2.2.1. Tách chiết và tinh sạch ADN theo phương pháp CTAB
Nhìn chung tất cả các phương pháp tách chiết đều tuân theo một quy trình công nghệ, bao gồm các bước:
Phá vỡ tế bào loại protein và các tạp chất khác bằng các chất có hoạt tính bề mặt (CTAB) tủa ADN bằng Isopropanol hay Ethanol rửa kết tủa bằng cồn 70% hoà tan ADN trong TE hoặc H20.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp có sử dụng CTAB của Obara - Okeyo & Kako (1998) [8] có một số cải tiến nhỏ để tiến hành tách chiết ADN tổng số từ các mẫu cúc nghiên cứu.
* Quy trình:
- Nghiền 0,3g mẫu lá cúc trong nitơ lỏng bằng chày cối sứ thành dạng bột mịn, cho vào ống eppendoff 2 ml.
- Bổ sung 800ml đệm chiết CTAB có nhiệt độ 60oC và 60ml dung dịch SDS 10% vào mẫu rồi cho vào máy vortex đảo đều.
- Ủ mẫu trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 65oC trong 30 phút, lấy ra để nguội ở nhiệt độ phòng.
- Bổ sung chloroform với tỉ lệ 1:1 về thể tích so với dịch mẫu sau đó đảo đều.
- Ly tâm 11.500 vòng/phút ở nhiệt độ 4oC trong 15 phút. Hút dịch nổi phía trên sang ống eppendoff mới, bỏ cặn.
- Bổ sung 2µl RNase (nồng độ 10µg/ml) vào dung dịch thu được, ủ ở nhiệt độ 37oC trong 1giờ.
- Bổ sung 2- propanol với tỉ lệ 1:1 về thể tích để thu tủa DNA. Ly tâm 11.500 vòng/phút ở nhiệt độ 4oC trong 10 phút để thu tủa.
- Loại bỏ dịch nổi phía trên, rửa kết tủa DNA bằng ethanol 70% rồi làm khô DNA ở nhiệt độ phòng.
- Hoà tan DNA bằng đệm TE. Kiểm tra nồng độ và chất lượng DNA bằng cách điện di 5µl dung dịch DNA trên gel agarose 1% với thang nồng độ DNA chuẩn là 25µg.