Profitt cùng cộng sự đã nghien cứu bào chế liposome AMB từ các tá dược HSPC, DSPG, cholesterol bằng phương pháp hydrat hóa màng film: AMB phân tán trong hỗn hợp dung môi methanol/chloroform được thêm vào dung dịch DSPG đã acid hóa. HSPC và cholesterol được hòa tan vào hỗn hợp dung môi methanol/chloroforom và được bổ sung vào dung dịch DSPG – AMB. Dung dịch thu được bao gồm AMB và các thành phần tạo vỏ được mang đi phun sấy tạo thành dạng bột phun sấy khô. Hydrat hóa bột phun sấy trên để thu được hỗn dịch liposome. Hỗn dịch liposome được làm giảm KTTP bằng cách lọc qua bộ lọc có kích thước lỗ màng 0,22 nm.Nồng độ của AMB trong hỗn dịch thu được là 1,86 mg/ml, được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Đường kính liposome trung
bình là 38,3 nm, được xác định bằng phương pháp nhiễu xạ ánh sáng động [26]. Nghiên cứu tại Việt Nam:
Ngô Thị Bích Phượng đã nghiên cứu bào chế liposome AMB bằng phương pháp bốc hơi pha đảo với các tá dược là SPC và cholesterol theo tỉ lệ mol 5:5, môi trường hydrat hóa là đệm phosphate pH 7,4, tỷ lệ % dược chất/tổng lượng lipid là 3mol% cho KTTP nhỏ (dưới 300 nm), phân bố kích thước hẹp (PDI< 0,3) và hiệu suất liposome hóa cao (khoảng 90%) [6].
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu.
- Đối tượng nghiên cứu: liposome AMB. - Nguyên liệu:
Bảng 2.1. Nguyên liệu
STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn
1 Amphotericin B Trung Quốc USP
2 Cholesterol Trung Quốc NSX
3
Phosphatidylcholin đậu nành đã hydrogen hóa (hydrogenated soy phosphatidylcholin)
Lipoid – Đức NSX
4 Distearoyl phosphatidylglycerol Lipoid – Đức NSX
5 Chloroform Labscan – Thái Lan NSX
6 Methanol Trung Quốc TKHH
7 Nước cất 2 lần Việt Nam DĐVN
8 Dinatri hydrophosphat Trung Quốc TKHH
9 Acid citric Trung Quốc NSX
10 Acid succinic Trung Quốc NSX
11 Dung dịch glucose 5% tiêm
truyền tĩnh mạch Đức NSX
12 Lactose Trung Quốc NSX
13 Sucrose Trung Quốc NSX
14 Mannitol Trung Quốc NSX
15 Natri hydroxyd Trung Quốc NSX
16 Acid hydroclorid đặc Trung Quốc NSX
- Phương tiện nghiên cứu:
+ Hệ thống cất quay Rovapor R – 210 (Buchi – Đức), bình cầu NS 29/32, dung tích 1000 ml (Buchi – Đức).
+ Hệ thống thiết bị phân tích kích thước Zetasizer nano ZS90 (Malvern – Anh). + Thiết bị đùn mini extruder (Eastern Scientific – Mỹ).
+ Thiết bị đùn cao áp EmulsiFlex-c5 (Avestin – Canada). + Bể siêu âm Ultrasonic LC 60H.
+ Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) JEOL 1010 (Nhật Bản).
+ Cân phân tích Satorius BP121S, máy đo pH InoLab, tủ sấy, tủ lạnh, cân kỹ thuật, các dụng cụ thủy tinh, lọ thủy tinh trung tính.
+ Máy đông khô Labocono Freezone Triad 740030.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Xây dựng phương pháp định lượng AMB trong liposome. - Khảo sát độ tan của AMB trong methanol tại các pH khác nhau.
- Khảo sát một số yếu tố thuộc về công thức ảnh hưởng đến đặc tính của liposome AMB.
- Bước đầu đông khô liposome và khảo sát ảnh hưởng của tá dược đông khô đến đặc tính liposome.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp xác định độ tan của AMB trong methanol tại các pH khác nhau khác nhau
- Tiến hành khảo sát độ tan của AMB trong methanol tại các pH lần lượt là 1, 2, 3 (điều chỉnh pH bằng HCl 2,5N trong methanol).
- Cân một lượng dư AMB (khoảng 0,2 g AMB), cho vào bình nón có nút mài dung tích 250 ml, thêm khoảng 50 ml môi trường khảo sát, khuấy từ liên tục trong 24h, 36h, 48h ở nhiệt độ phòng.
- Sau các khoảng thời gian 24h, 36h, 48h, hút khoảng 5 ml dịch, đem ly tâm ở tốc độ 12000 vòng/phút trong 30 phút, nhiệt độ phòng để loại phần AMB không tan. Lấy phần dịch phía trên, đem lọc qua màng PTFE 0,45 µm.
- Tiến hành xác định nồng độ AMB trong từng môi trường bằng phương pháp đo quang với các điều kiện được mô tả ở mục 2.3.5.3, thu được kết quả là độ hấp thu quang Ai.
- Xác định nồng độ AMB (Ci) trong từng môi trường bằng phương pháp so sánh độ hấp thụ quang với dung địch AMB chuẩn pha trong dung môi thử có nồng độ C0, độ hấp thụ quang A0, xác định Ci = 𝐴𝑖
2.3.2. Phương pháp bào chế liposome AMB
Quy trình bào chế liposome AMB như sau:
Cân và phân tán AMB trong 15 ml methanol (hỗn dịch 1).
Cân và hòa tan DSPG trong 15 ml methanol:chloroform tỉ lệ 1:1 đã được chỉnh pH 1 bằng HCl 2,5N trong methanol (dung dịch 2).
Cân và hòa tan HSPC, cholesterol trong 10 ml methanol:chloroform tỉ lệ 1:1 (dung dịch 3).
Phối hợp hỗn dịch 1 và dung dịch 2, khuấy để thu được dung dịch đồng nhất. Sau đó phối hợp thêm dung dịch 3 vào dung dịch đã thu được ở trên.
Cân 3g bi thủy tinh cho vào bình cầu dung tích 1000 ml của hệ thống cất quay. Chuyển dung dịch lipid vào bình cầu. Tiến hành cất quay ở điều kiện nhiệt độ 41oC, tốc độ quay 150 vòng/phút. Hệ thống cất quay được hút chân không, điều chỉnh áp suất để dung môi bay hơi từ từ. Sau 30 phút hút chân không, dung môi bay hơi hết và màng film được hình thành thì giảm tốc độ quay xuống 100 vòng/phút. Tiếp tục cất quay thêm 15 tiếng nữa để đảm bảo loại hết hoàn toàn dung môi hữu cơ.
Tiến hành hydrat hóa màng film bằng dung dịch hydrat hóa thích. Quá trình hydrat hóa được tiến hành ở điều kiện nhiệt độ 41oC, tốc độ quay 250 vòng/phút trong 15 phút để đảm bảo màng film đã được hydrat hóa hoàn toàn. Hỗn dịch liposome thu được đem làm nhỏ kích thước tiểu phân bằng các phương pháp được mô tả ở mục 2.3.3.
Liposome AMB thu được đóng trong lọ thủy tinh, đậy kín, bọc giấy bạc và bảo quản ở nhiệt độ 2 – 80C.
Quy trình bào chế được trình bày trong sơ đồ sau:
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình bào chế liposome AMB bằng phương pháp hydrat hóa màng film. DSPG / (MeOH+CHCl3) 15ml (tỉ lệ 1:1) Phân tán AMB/MeOH 15ml HCl 2,5M
Dung dịch đã acid hóa pH = 1,0 Tạo phức DSPG với AMB Phối hợp (HSPC+Cholesterol)(MeOH+CHCl3) (10ml tỉ lệ 1:1) Cất quay trong bình đáy tròn Bi thủy tinh (3g) Điều nhiệt 41oC Tốc độ quay 150 vòng/phút, sau 30 phút giảm còn 100 vòng/phút Thời gian 15h Hydrat hóa
Dung dịch Hydrat hóa: Glucose, đệm Citrat, phosphate, Succinat, … Điều nhiệt 410C Tốc độ quay 250 vòng/phút Thời gian 15 phút Sản phẩm: Liposome thô
Làm nhỏ KTTP Đùn ép, siêu âm, đồng nhất hóa...
Tá dược đông khô
Đông khô
Bảo quản Lớp film mỏng
2.3.3. Phương pháp làm giảm và đồng nhất KTTP liposome
2.3.3.1. Đùn ép tuần tự sử dụng mini – extruder
Liposome thu được sau bào chế được đùn ép lần lượt dưới áp suất thấp sử dụng thiết bị đùn mini extruder:
- Nâng nhiệt độ của mẫu lên 500C và giữ nhiệt trong suốt quá trình đùn (dùng bể điều nhiệt).
- Đùn lần lượt mẫu qua các màng polycarbonat kích thước 1000 – 400– 200 nm, mỗi mẫu đùn qua 29 lần.
2.3.3.2. Siêu âm sau đó đùn ép tuần tự sử dụng mini – extruder
Liposome thu được sau bào chế được siêu âm để làm giảm KTTP sau đó đùn ép qua thiết bị mini extruder để mẫu đồng nhất hơn, giảm chỉ số PDI:
- Chia mẫu thành các phần 15 ml mẫu, cho vào cốc có mỏ dung tích 25 ml, tiến hành khảo sát quá trình siêu âm: siêu âm liên tục trong 3 phút và siêu âm ngắt quãng trong 3 phút, 5 phút, 7 phút. Trong quá trình siêu âm có sử dụng nước đá để tránh tăng nhiệt cục bộ hỗn dịch liposome. Mẫu thu được đánh giá các đặc tính để chọn ra điều kiện thích hợp nhất cho quá trình siêu âm.
- Mẫu có KTTP và phân bố KTTP có giá trị nhỏ nhất được lựa chọn để thực hiện quá trình đùn ép qua màng polycarbonat kích thước lỗ lọc 200 nm dưới áp suất thấp.
2.3.3.3. Đùn ép dưới áp suất cao
Liposome sau bào chế được đùn ép dưới áp lực cao, sử dụng thiệt bị đùn cao áp EmulsiFlex-c5.
- Điều kiện đùn: màng polycarbonat kích thước lỗ lọc 400 nm, áp suất 80 – 100 Psi, khảo sát thời gian đùn tuần hoàn trong 1 phút, 4 phút và 6 phút để lựa chọn điều kiện thích hợp cho quá trình đùn ép.
2.3.4. Đông khô liposome
Bước đầu thực hiện quá trình đông khô để tăng độ ổn định của liposome trong bảo quản:
- Tiến hành lựa chọn tá dược động khô: Lựa chọn các tá dược đông khô là lactose, sucrose và mannitol với tỉ lệ số mol đường : tổng số mol lipid = 10:1.
- Bào chế liposome AMB theo phương pháp trình bày ở mục 2.3.2. Bổ sung tá dược đông khô vào dung dịch dùng để hydrat hóa.
- Đồng nhất và làm giảm KTTP theo phương pháp đùn ép dưới áp suất thấp được mô tả ở mục 2.3.3.
- Hút chính xác mỗi 2 ml hỗn dịch liposome sau khi giảm KTTP, cho vào lọ thủy tinh dung tích 10 ml, đông khô theo quy trình: làm đông xuống - 600C, giữ trong 8h; hút chân không áp suất 0,1 mBar, gia nhiệt với tốc độ 0,10C/phút đến 300C, giữ trong 8h.
2.3.5. Phương pháp đánh giá một số đặc tính của liposome AMB.
2.3.5.1. Phương pháp đánh giá hình thức, hình thái, phân bố KTTP, thế Zeta của liposome.
- Về hình thức: liposome AMB sau khi đùn ép phải là hỗn dịch đục, màu vàng nhạt, không có lắng cặn tinh thể, không có các tiểu phân có kích thước lớn có thể quan sát được bằng mắt thường.
- Đánh giá kích thước tiểu phân (KTTP), phân bố KTTP bằng phương pháp nhiễu xạ ánh sáng động (DLS) với thiết bị đánh giá Zetasizer ZS 90:
+ Pha loãng hỗn dịch liposome 10 lần bằng nước tinh khiết đã lọc qua màng cellulose acetat 0,2 µm, tiến hành đo KTTP. Thiết bị cũng cho giá trị về chỉ số đa phân tán PDI của hệ.
+ Zaverage, PDI: chỉ số Zaverage (đơn vị đo “d.nm”: số nanomet đường kính tiểu phân) gần tương đương với KTTP trung bình của mẫu khi giá trị PDI nhỏ và dùng để so sánh về kích thước giữa các mẫu liposome khác nhau. Khi PDI lớn (PDI>0,5) thì chỉ số Zaverage không có ý nghĩa so sánh, khi đó cần phải dựa vào vị trí và diện tích các peak trên đồ phân bố KTTP để so sánh kích thước giữa các mẫu.
- Đánh giá thế zeta với thiệt bị đánh giá Zetasizer ZS 90:
+ Tiến hành pha mẫu đo tương tự như đánh giá KTTP và tiến hành đo thế zeta. + Thế Zeta: thế Zeta cho biết khả năng tích điện của liposome. Sự tích điện càng lớn thì càng hạn chế sự kết tụ liposome. Chỉ số này có thể âm hoặc dương. Có thể so sánh thế zeta của các mẫu để dự đoán xu hướng ổn định của các mẫu trong bảo quản.
2.3.5.2. Phương pháp đánh giá hiệu suất liposome hóa
a, Phương pháp định lượng AMB trong hỗn dịch liposome.
Xác định hàm lượng AMB trong hỗn dịch liposome bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV - VIS:
Điều kiện đo:
- Máy đo quang Hitachi U – 1800 (Nhật Bản). - Cuvet: thạch anh
- Bước sóng: 405 nm - Dung môi: methanol
Khoảng nồng độ tuyến tính: 1 – 6 µg/ml Pha mẫu chuẩn và mẫu thử:
Mẫu chuẩn:
Cân chính xác 0,01 g AMB hòa tan bằng methanol trong bình định mức 50 ml, bổ sung methanol đến vạch, thu được dung dịch gốc có nồng độ 200 µg/ml. Hút chính xác một thể tích dung dịch gốc, pha loãng bằng dung môi methanol đến khi thu được dung dịch chuẩn có nồng độ thích hợp.
Mẫu thử:
Hút chính xác 1 ml mẫu thử, hòa tan bằng hỗn hợp dung môi methanol:chloroform tỉ lệ 3:1 v/v trong bình định mức 10 ml, bổ sung thể tích đến vạch. Hút chính xác 1 ml dung dịch trên, pha loãng bằng dung môi methanol trong bình định mức 25 ml, bổ sung thể tích đến vạch.
Hàm lượng AMB được xác định bằng công thức: CT = 𝐴𝑡
𝐴𝑐 x mc x k. Trong đó:
CT : nồng độ AMB trong hỗn dịch liposome (mg/ml). At : độ hấp thụ quang của mẫu thử.
Ac : độ hấp thụ quang của mẫu chuẩn. mc : khối lượng cân của mẫu chuẩn (mg). k : hệ số pha loãng.
b, Phương pháp xác định hiệu suất liposome hóa.
Định lượng AMB toàn phần: nồng độ AMB trong hỗn dịch liposome thô. Hút chính xác 1 ml hỗn dịch liposome thô, pha loãng mẫu như mô tả ở mục 2.3.5.2.a. Đo quang mẫu ở bước sóng 405 nm thu được độ hấp thu quang là A1.
Định lượng AMB gắn trong lớp lipid của liposome: để đánh giá được lượng AMB gắn với lipid cần loại bỏ phần AMB tự do. AMB tự do không tan trong nước ở dạng kết tủa và bị loại đi trong quá trình đùn ép lần lượt qua các màng 1000 – 400 – 200 nm. Hỗn dịch thu được sau khi đã loại AMB kết tủa: hút chính xác 1 ml hỗn dịch liposome sau đùn ép, pha loãng mẫu như mô tả ở phần 2.3.5.2 Tiến hành đo quang mẫu ở bước sóng 405 nm thu được độ hấp thụ quang A2.
Hiệu suất liposome hóa được xác định bằng công thức: H1% = 𝐴2
𝐴1 x 100%. Hiệu suất quy trình được xác định như sau:
H2% = 𝐴2
𝐴0 𝑥 𝑚𝑐 𝑥 𝑘
𝑚0 x 100%
Trong đó:
A2 : độ hấp thụ quang của mẫu sau đùn ép. A0 : độ hấp thụ quang của mẫu chuẩn. mc : khối lượng cân mẫu chuẩn (mg).
m0 : khối lượng cân ban đầu của AMB (mg). k : hệ số pha loãng.
Mức độ thay đổi hiệu suất liposome hóa được tính như sau: H3 % = 𝐻𝑎−𝐻𝑏
𝐻𝑏 x 100 %
Trong đó: Ha là hiệu suất liposome hóa trước bảo quản (hay trước đông khô).
Hb là hiệu suất liposome hóa sau bảo quản (hay sau đông khô).
2.3.5.3. Tính ổn định của liposome AMB
Đánh giá KTTP, phân bố KTTP, thế Zeta, hiệu suất liposome hóa khi bảo quản ở 2 -8 0C sau 3 tuần.
Tiến hành:
lắc đều và lấy mẫu đem pha loãng để đo KTTP và thế Zeta như hướng dẫn ở mục 2.3.5.1.
+ Để đánh giá hiệu suất của mẫu sau bảo quản so với trước bảo quản: lấy mẫu liposome sau bảo quản đem đùn 1 lần qua màng polycarbonat kích thước lỗ màng 200 nm bằng thiết bị mini extruder để loại AMB tự do trong hỗn dịch liposome, sau đó tiến hành định lượng và xác định hiệu suất như hướng dẫn ở mục 2.3.5.3.
2.4. Điều kiện thí nghiệm
AMB bị mất hoạt tính khi tiếp xúc với ánh sáng, do đó quá trình bào chế và đánh giá cần thiết được tiến hành trong điều kiện tránh ánh sáng.
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.
3.1. Xây dựng phương pháp định lượng AMB bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-VIS quang phổ hấp thụ UV-VIS
3.1.1. Quét phổ dung dịch chuẩn AMB trong methanol
+ Chuẩn bị mẫu chuẩn như hướng dẫn ở mục 2.3.5.2.
+ Tiến hành quét phổ dung dịch chuẩn AMB trong khoảng bước sóng 200 – 500 nm để tìm cực đại hấp thụ của AMB trong mẫu chuẩn.
Nhận xét:
AMB trong methanol có các cực đại hấp thụ tại 345, 463, 382 và 405 nm. Tại bước sóng 405 nm, độ hấp thụ quang của AMB là khá cao nên có thể áp dụng để định lượng AMB trong hỗn dịch liposome bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-VIS.
Hình 3.1: Phổ hấp thụ UV-VIS của AMB
____ (mẫu chuẩn); ____ (mẫu thử); ____ (mẫu trắng)
3.1.2. Khảo sát độ đặc hiệu
+ Chuẩn bị mẫu thử có nồng độ AMB tương đương mẫu chuẩn (mục 2.3.5.2).
+ Chuẩn bị mẫu trắng là liposome trắng có thành phần HSPC, DSPG và cholesterol tương tự mẫu thử và được pha loãng giống mẫu thử.
+ Tiến hành quét phổ các dung dịch trong khoảng bước sóng 200 – 500 nm để tìm cực đại hấp thụ của AMB trong mẫu thử và mẫu trắng thu được phổ hấp thụ UV ở hình 3.1.
Nhận xét:
Kết quả quét phổ ở hình 3.1 cho thấy cả (mẫu chuẩn) và (mẫu thử) đều có cùng 1 cực đại hấp thụ ở λmax=405 nm, đồng thời (mẫu trắng) không hấp thụ tại bước sóng 405nm. Điều này chứng tỏ HSPC, DSPG và cholesterol không hấp thụ tại bước sóng