2.3.5.1. Phương pháp đánh giá hình thức, hình thái, phân bố KTTP, thế Zeta của liposome.
- Về hình thức: liposome AMB sau khi đùn ép phải là hỗn dịch đục, màu vàng nhạt, không có lắng cặn tinh thể, không có các tiểu phân có kích thước lớn có thể quan sát được bằng mắt thường.
- Đánh giá kích thước tiểu phân (KTTP), phân bố KTTP bằng phương pháp nhiễu xạ ánh sáng động (DLS) với thiết bị đánh giá Zetasizer ZS 90:
+ Pha loãng hỗn dịch liposome 10 lần bằng nước tinh khiết đã lọc qua màng cellulose acetat 0,2 µm, tiến hành đo KTTP. Thiết bị cũng cho giá trị về chỉ số đa phân tán PDI của hệ.
+ Zaverage, PDI: chỉ số Zaverage (đơn vị đo “d.nm”: số nanomet đường kính tiểu phân) gần tương đương với KTTP trung bình của mẫu khi giá trị PDI nhỏ và dùng để so sánh về kích thước giữa các mẫu liposome khác nhau. Khi PDI lớn (PDI>0,5) thì chỉ số Zaverage không có ý nghĩa so sánh, khi đó cần phải dựa vào vị trí và diện tích các peak trên đồ phân bố KTTP để so sánh kích thước giữa các mẫu.
- Đánh giá thế zeta với thiệt bị đánh giá Zetasizer ZS 90:
+ Tiến hành pha mẫu đo tương tự như đánh giá KTTP và tiến hành đo thế zeta. + Thế Zeta: thế Zeta cho biết khả năng tích điện của liposome. Sự tích điện càng lớn thì càng hạn chế sự kết tụ liposome. Chỉ số này có thể âm hoặc dương. Có thể so sánh thế zeta của các mẫu để dự đoán xu hướng ổn định của các mẫu trong bảo quản.
2.3.5.2. Phương pháp đánh giá hiệu suất liposome hóa
a, Phương pháp định lượng AMB trong hỗn dịch liposome.
Xác định hàm lượng AMB trong hỗn dịch liposome bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV - VIS:
Điều kiện đo:
- Máy đo quang Hitachi U – 1800 (Nhật Bản). - Cuvet: thạch anh
- Bước sóng: 405 nm - Dung môi: methanol
Khoảng nồng độ tuyến tính: 1 – 6 µg/ml Pha mẫu chuẩn và mẫu thử:
Mẫu chuẩn:
Cân chính xác 0,01 g AMB hòa tan bằng methanol trong bình định mức 50 ml, bổ sung methanol đến vạch, thu được dung dịch gốc có nồng độ 200 µg/ml. Hút chính xác một thể tích dung dịch gốc, pha loãng bằng dung môi methanol đến khi thu được dung dịch chuẩn có nồng độ thích hợp.
Mẫu thử:
Hút chính xác 1 ml mẫu thử, hòa tan bằng hỗn hợp dung môi methanol:chloroform tỉ lệ 3:1 v/v trong bình định mức 10 ml, bổ sung thể tích đến vạch. Hút chính xác 1 ml dung dịch trên, pha loãng bằng dung môi methanol trong bình định mức 25 ml, bổ sung thể tích đến vạch.
Hàm lượng AMB được xác định bằng công thức: CT = 𝐴𝑡
𝐴𝑐 x mc x k. Trong đó:
CT : nồng độ AMB trong hỗn dịch liposome (mg/ml). At : độ hấp thụ quang của mẫu thử.
Ac : độ hấp thụ quang của mẫu chuẩn. mc : khối lượng cân của mẫu chuẩn (mg). k : hệ số pha loãng.
b, Phương pháp xác định hiệu suất liposome hóa.
Định lượng AMB toàn phần: nồng độ AMB trong hỗn dịch liposome thô. Hút chính xác 1 ml hỗn dịch liposome thô, pha loãng mẫu như mô tả ở mục 2.3.5.2.a. Đo quang mẫu ở bước sóng 405 nm thu được độ hấp thu quang là A1.
Định lượng AMB gắn trong lớp lipid của liposome: để đánh giá được lượng AMB gắn với lipid cần loại bỏ phần AMB tự do. AMB tự do không tan trong nước ở dạng kết tủa và bị loại đi trong quá trình đùn ép lần lượt qua các màng 1000 – 400 – 200 nm. Hỗn dịch thu được sau khi đã loại AMB kết tủa: hút chính xác 1 ml hỗn dịch liposome sau đùn ép, pha loãng mẫu như mô tả ở phần 2.3.5.2 Tiến hành đo quang mẫu ở bước sóng 405 nm thu được độ hấp thụ quang A2.
Hiệu suất liposome hóa được xác định bằng công thức: H1% = 𝐴2
𝐴1 x 100%. Hiệu suất quy trình được xác định như sau:
H2% = 𝐴2
𝐴0 𝑥 𝑚𝑐 𝑥 𝑘
𝑚0 x 100%
Trong đó:
A2 : độ hấp thụ quang của mẫu sau đùn ép. A0 : độ hấp thụ quang của mẫu chuẩn. mc : khối lượng cân mẫu chuẩn (mg).
m0 : khối lượng cân ban đầu của AMB (mg). k : hệ số pha loãng.
Mức độ thay đổi hiệu suất liposome hóa được tính như sau: H3 % = 𝐻𝑎−𝐻𝑏
𝐻𝑏 x 100 %
Trong đó: Ha là hiệu suất liposome hóa trước bảo quản (hay trước đông khô).
Hb là hiệu suất liposome hóa sau bảo quản (hay sau đông khô).
2.3.5.3. Tính ổn định của liposome AMB
Đánh giá KTTP, phân bố KTTP, thế Zeta, hiệu suất liposome hóa khi bảo quản ở 2 -8 0C sau 3 tuần.
Tiến hành:
lắc đều và lấy mẫu đem pha loãng để đo KTTP và thế Zeta như hướng dẫn ở mục 2.3.5.1.
+ Để đánh giá hiệu suất của mẫu sau bảo quản so với trước bảo quản: lấy mẫu liposome sau bảo quản đem đùn 1 lần qua màng polycarbonat kích thước lỗ màng 200 nm bằng thiết bị mini extruder để loại AMB tự do trong hỗn dịch liposome, sau đó tiến hành định lượng và xác định hiệu suất như hướng dẫn ở mục 2.3.5.3.