Vật liệu thí nghiệm - khảo sát bệnh lý của virus v- 123docz.net

3.2.4.1 Vật liệu

Trứng vịt có phôi 12 ngày tuổi (nguồn: trứng được mua từ hộ chăn nuôi vịt tỉnh Vĩnh Long và đã xác định là không có kháng thể kháng virus viêm gan vịt type I bằng phản ứng trung hòa).

Vịt con 1 - 2 ngày tuổi (nguồn: trứng được mua từ hộ chăn nuôi vịt tỉnh Vĩnh Long đã xác định là không có kháng thể kháng virus viêm gan vịt type I bằng phản ứng trung hòa và được ấp nở tại phòng thí nghiệm).

3.2.4.2Dụng cụ

Ống tiêm y tế 1 ml, găng tay, khẩu trang, giá đựng ống nghiệm, bông gòn, bình trử lạnh, type nhựa đựng huyết thanh, micropipette, ống falcon, kéo, dao

mổ, đèn cồn, paraffin, máy ấp trứng, đèn soi trứng, máy chụp ảnh, máng ăn, máng uống, chuồng nuôi, đèn sưởi.

3.2.4.3 Hóa chất và sinh phẩm

Dung dịch PBS, dung dịch sinh lý 0,85 %, nước cất, cồn. 3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Chuẩn bị nuôi vịt thí nghiệm

+ Giống vịt nuôi thí nghiệm: vịt con 1-2 ngày tuổi giống CV Supper-M, khỏe mạnh, số lượng 25 con.

+ Mật độ nuôi: 5 con/ô chuồng 1m2.

+ Chuẩn bị chuồng nuôi: chuồng nuôi là dạng chuồng lồng diện tích 1mx1mx0,7m, xung quanh bao bằng lưới chì. Nền chuồng lót bằng rơm. Chuồng được phun sát trùng bằng iodine trước khi đưa vịt vào nuôi.

+ Thức ăn: Thức ăn sử dụng nuôi vịt thí nghiệm là thức ăn của công ty Cargill. Vịt được cho ăn tự do bằng thức ăn viên dùng cho vịt con từ 1 - 42 ngày tuổi, có hàm lượng đạm 20 %.

+ Quy trình chăm sóc: Vịt con 1 – 2 ngày tuổi được nuôi úm trên chuồng, mỗi ô chuồng được trang bị 1 bóng đèn 75W. Xung quanh được che kín tránh mưa tạt gió lùa, phần nền sử dụng rơm làm chất độn chuồng.

3.3.2 Phương pháp tiêm truyền trên phôi vịt thí nghiệm

Mục tiêu: Xác định liều gây chết 50 % trên phôi vịt và khảo sát bệnh lý của virus viêm gan vịt type I gây ra trên phôi vịt.

Bố trí thí nghiệm:

Chuẩn bị trứng: chọn 50 trứng vịt sạch, có trọng lượng và kích thước tương đối đồng đều được lấy từ đàn vịt bố mẹ khỏe mạnh, chưa được tiêm vaccine phòng bệnh viêm gan do virus ở vịt. Sát trùng bằng cồn 70o sau đó đem ấp ở nhiệt độ 37oC. Sau khi ấp 7 ngày tiến hành soi trứng để loại bỏ những trứng không phôi hoặc chết phôi. Trứng ấp đến 12 ngày tuổi soi lại lần 2 chọn trứng có phôi còn sống để gây nhiễm virus.

Cách tiêm: soi trứng, dùng bút chì đánh dấu buồng hơi và đầu phôi và mạch máu. Sát trùng vỏ trứng bằng cồn 70o. Dùng dùi nhọn dùi thủng vỏ trứng ngay đỉnh buồng hơi và một lỗ ở vị trí tiêm xa phôi và xa mạch máu. Sau khi tiêm xong hàn vỏ trứng lại bằng paraffine và cho vào máy ấp ở 37oC.

Dung dịch tiêm: dùng virus viêm gan vịt type I pha loãng với dung dịch PBS thành 8 nồng độ theo cơ số 10 từ 10-1 đến 10-8 , mỗi nồng độ tiêm cho 5 trứng vịt có phôi, mỗi trứng tiêm 0,2 ml dung dịch virus viêm gan vịt type I vào xoang niệu mô. Bố trí thí nghiệm được trình bày qua bảng 3.1.

Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm gây nhiễm trên phôi vịt Độ pha loãng

virus

Số trứng Liều virus (ml)

Vị trí tiêm

10-1 5 0,2 Xoang niệu mô

10-2 5 0,2 Xoang niệu mô

10-3 5 0,2 Xoang niệu mô

10-4 5 0,2 Xoang niệu mô

10-5 5 0,2 Xoang niệu mô

10-6 5 0,2 Xoang niệu mô

10-7 5 0,2 Xoang niệu mô

10-8 5 0,2 Xoang niệu mô

Sau khi tiêm, định kỳ 6 giờ soi trứng một lần để kiểm tra phôi. Nếu phôi chết thì mổ trứng ra để quan sát bệnh tích trên phôi, ghi nhận bệnh tích và thời gian chết phôi.

Cách tính liều ELD50: tính liều ELD50 nhờ vào phương pháp Biometry của Reed & Muench (1938).

dp = % 50 % 50 50 50      L L L lg ELD50 = lg ELD<50 + dp x lg f Chú thích

dp (Proportion dose): khoảng cách tỷ lệ L<50%: phần trăm tử số chết dưới 50 % L>50%: phần trăm tử số chết trên 50 % lg f: Lg10 = 1

Chỉ tiêu theo dõi

Tỷ lệ chết phôi theo nồng độ (%) = x 100

Tỷ lệ phôi chết theo thời gian (%) = x 100 Số phôi chết cùng nồng độ

Tổng số phôi của nồng độ

Số phôi chết cùng thời điểm Tổng số phôi thí nghiệm

Tần suất xuất hiện bệnh tích trên phôi (%) = x 100

3.3.3 Phương pháp gây nhiễm thực nghiệm trên vịt con

Mục tiêu: Gây nhiễm thực nghiệm trên vịt con để xác định liều gây chết 50 % trên vịt con và khảo sát bệnh lý của virus viêm gan vịt type I gây ra trên vịt con.

Bố trí thí nghiệm: Sử dụng 25 vịt con 1 – 2 ngày tuổi khỏe mạnh để gây nhiễm thực nghiệm. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên thông qua 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 5 vịt con, các nghiệm thức phải được bố trí riêng lẻ. Các nhóm vịt được xử lí bằng DHV type I theo nồng độ từ 10-1 đến 10-5 bằng cách tiêm bắp huyễn dịch virus với liều 0,5ml/con.

Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm gây nhiễm trên vịt con Nghiệm

thức

Nồng độ pha loãng virus

Số vịt Liều virus Vị trí tiêm

1 10-1 5 0,5 ml Tiêm bắp

2 10-2 5 0,5 ml Tiêm bắp

3 10-3 5 0,5 ml Tiêm bắp

4 10-4 5 0,5 ml Tiêm bắp

5 10-5 5 0,5 ml Tiêm bắp

Trong thời gian thí nghiệm vịt được chăm sóc, nuôi dưỡng tốt. Tiến hành quan sát và theo dõi vịt ở các nghiệm thức, ghi nhận lại các triệu chứng, khi vịt chết tiến hành mổ khám, ghi nhận bệnh tích.

Cách tính liều LD50: tính liều LD50 dựa vào phương pháp Biometry của Reed & Muench (1938).

Chỉ tiêu theo dõi

Tỷ lệ vịt chết (%) = x 100 Tỷ lệ vịt chết theo nghiệm thức (%) = x 100 Số vịt chết Tổng số vịt thí nghiệm Số vịt chết cùng nghiệm thức Tổng số vịt của nghiệm thức Số phôi có cùng bệnh tích Tổng số phôi chết

Tỷ lệ vịt chết theo ngày (%) = x 100

Tần suất xuất hiện triệu chứng (%) = x 100

Tần suất xuất hiện bệnh tích (%) = x 100

3.3.4 Thống kê và xử lý số liệu

Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel

Số liệu khảo sát thời gian chết phôi được xử lý bằng phần mềm Minitab 1.6 Số vịt chết trong ngày Tổng số vịt thí nghiệm Số vịt có cùng triệu chứng Tổng số vịt thí nghiệm Số vịt có cùng bệnh tích Tổng số vịt chết

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả xác định liều gây chết 50 % trên phôi vịt thí nghiệm

Sau khi tiêm virus viêm gan vịt type I vào phôi vịt 12 ngày tuổi từ nồng độ 10-1 đến 10-8, chúng tôi theo dõi và ghi nhận tỷ lệ phôi chết theo các nồng độ và kết quả theo dõi được trình bày qua bảng 4.1

Bảng 4.1 Kết quả xác định liều gây chết 50 % trên phôi vịt

Độ pha loãng lg

Số thật Số tổng hợp Tỷ lệ

Phôi chết Phôi sống Phôi chết Phôi sống Số chết %

-1 5 0 6 0 6/6 100 -2 1 4 1 4 1/5 20 -3 0 5 0 9 0/9 0 -4 0 5 0 14 0/14 0 -5 0 5 0 19 0/19 0 -6 0 5 0 24 0/24 0 -7 0 5 0 29 0/29 0 -8 0 5 0 34 0/34 0

Qua bảng 4.1 cho thấy ở độ pha loãng 1:101 có 5 phôi chết, tỷ lệ chết phôi là 100 %. Ở độ pha loãng 1:102 có 1 phôi chết, tỷ lệ chết phôi là 20 %, ở các độ pha loãng từ 1:103 đến 1:108 không có phôi chết. Kết quả xác định liều gây chết 50 % trên phôi vịt được tính dựa vào phương Biometry của Reed & Muench như sau:

Khoảng cách tỷ lệ dp giữa 2 độ pha loãng 1:101 và 1:102 dp = % 50 % 50 50 50      L L L = 20 100 20 50   = 0,38 lg ELD50 = lgELD < 50 + dp x lgf = -2 + 0,38 x 1 = -1,62

Kết quả trên cho thấy ở độ pha loãng 1:101,62 khi tiêm 0,2 ml gây chết 50 % phôi vịt thí nghiệm, nghĩa là 0,2 ml huyễn dịch virus đặc có chứa 101,62 liều gây chết 50 % trên phôi. Vậy 1ml huyễn dịch đặc virus sử dụng có chứa

2 , 0

4.2 Kết quả theo dõi thời gian chết phôi trung bình theo nồng độ

Sau khi gây nhiễm trên phôi chúng tôi tiến hành soi trứng định kỳ 6giờ/lần trong vòng 72 giờ và ghi nhận được kết quả qua bảng 4.2

Bảng 4.2 Kết quả theo dõi thời gian chết phôi trung bình theo nồng độ (n=40)

Độ pha loãng

virus Số mẫu Số phôi chết

Thời gian chết trung bình (giờ) (X SE) 10-1 5 5/5 301,9 10-2 5 1/5 42 10-3 5 0 0 10-4 5 0 0 10-5 5 0 0 10-6 5 0 0 10-7 5 0 0 10-8 5 0 0

X : Thời gian chết trung bình SE: Sai số chuẩn

Qua bảng 4.2 ta thấy khi tiêm virus viêm gan vịt type I vào xoang niệu mô 24 giờ thì xuất hiện phôi chết. Thời gian chết phôi trung bình ở nồng độ 10-1 là 30 giờ, ở nồng độ 10-2 là 42 giờ. Như vây, chủng virus sử dụng đã nhân lên được trên phôi và đã gây chết phôi. Các nồng độ từ 10-3 đến 10-5 không có phôi chết có thể là do virus pha loãng không đủ độc lực gây chết phôi.

Theo OIE (2000), virus viêm gan vịt type I khi nuôi cấy trên phôi vịt 10 - 14 ngày tuổi, virus gây chết phôi trong vòng 24 - 72 giờ sau khi tiêm. Theo nghiên cứu của Nguyễn Khánh Ly (2004), virus phân lập từ ổ dịch viêm gan vịt ở Hà Nam, khi nuôi cấy trên phôi vịt 10 - 14 ngày tuổi virus gây chết phôi sau khi tiêm 48 giờ là 70,7 %, tỷ lệ chết phôi từ 60 – 100 %. Phôi chết có biểu hiện còi cọc, xuất huyết toàn thân, phù dưới da bụng, gan phôi xuất huyết.

4.3 Kết quả khảo sát bệnh tích của virus viêm gan vịt gây ra trên phôi Qua mổ khám các phôi chết sau khi gây nhiễm, chúng tôi ghi nhận được Qua mổ khám các phôi chết sau khi gây nhiễm, chúng tôi ghi nhận được những bệnh tích đặc trưng và được trình bày qua bảng 4.3

Bảng 4.3 Tần suất xuất hiện bệnh tích trên phôi vịt thí nghiệm (n=6)

Bệnh tích Tần suất xuất hiện bệnh tích trên phôi theo nghiệm thức Tổng Tỷ lệ % 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 Phôi xuất huyết 5 1 0 0 0 0 0 0 6/6 100 Gan sưng 4 1 0 0 0 0 0 0 5/6 83,33 Phôi tích nước 3 0 0 0 0 0 0 0 3/6 50,00 Tim nhạt màu 2 0 0 0 0 0 0 0 2/6 33,33 Lách sưng 1 0 0 0 0 0 0 0 1/6 16,67 Thận sưng 1 0 0 0 0 0 0 0 1/6 16,67

Qua bảng 4.3 cho thấy bệnh tích điển hình xuất hiện tần suất cao nhất là phôi xuất huyết (100 %), kế đến là gan sưng (83,33 %), phôi phù thủng (50 %). Bên cạnh đó, một số bệnh tích xuất hiện ở các cơ quan khác với tần suất thấp hơn như: tim nhạt màu (33,33 %), lách sưng (16,67 %), thận sưng (16,67 %).

Kết quả trên cũng phù hợp với nghiên cứu của Levine và Fabricant (1950), tác giả cho biết khi tiêm virus vào xoang niệu mô phôi vịt 10 - 14 ngày tuổi, sau khi tiêm 24 -72 giờ thì phôi chết với bệnh tích đặc trưng như: phôi còi cọc, xuất huyết dưới da đặc biệt là vùng đầu, bụng và chân, phôi phù, gan phôi sưng có màu đỏ hoặc hơi vàng. Theo nghiên cứu của Bùi Thị Cúc (2002), virus phân lập từ các ổ dịch viêm gan vịt ở Hà Nam, Tuyên Quang, Hà Tây khi nuôi cấy trên phôi vịt 12 ngày tuổi, virus gây chết phôi sau 24 giờ. Phôi chết có bệnh tích còi cọc, xuất huyết toàn thân, phù dưới da, gan phôi xuất huyết, hoại tử, một số trường hợp tim phôi nhạt màu, lách sưng, thận tụ huyết.

Hình 4.2 Gan phôi sưng, xuất huyết

Hình 4.4 Gan phôi sưng, nhạt màu Hình 4.3 Tim phôi nhạt màu

4.4 Kết quả xác định liều gây chết 50 % trên vịt con

Sau khi tiêm virus viêm gan vịt type I vào vịt con 1 - 2 ngày tuổi từ nồng độ 10-1 đến 10-5, chúng tôi theo dõi và ghi nhận tỷ lệ chết theo các nồng độ và kết quả theo dõi được trình bày qua bảng 4.1

Bảng 4.4 Kết quả xác định liều gây chết 50 % trên vịt con

Độ pha loãng lg Số thật Số tổng hợp Tỷ lệ Chết Sống quá Chết Sống quá Số chết % -1 4 1 13 1 13/14 92,86 -2 3 2 9 3 9/12 75,00 -3 3 2 6 5 6/11 54,54 -4 2 3 3 8 3/11 27,27 -5 1 4 1 12 1/13 7,69

Qua bảng 4.4 cho thấy ở các độ pha loãng từ 1:101 đến 1:103 có tỷ lệ chết cao hơn 50 %, ở độ pha loãng 10-4 và 10-5 có tỷ lệ chết dưới 50 %. Ở độ pha loãng 1:101 có 4 vịt chết, chiếm tỷ lệ cao nhất, kế đến là ở độ pha loãng 1:102 và 1:103 mỗi nồng độ có 3 vịt chết. Ở độ pha loãng 1:104 có 2 vịt chết và ở độ pha loãng 1:105 có 1 vịt chết, chiếm tỷ lệ thấp nhất. Kết quả xác định liều gây chết 50 % trên vịt con dựa vào phương pháp Biometry của Reed & Muench được tính như sau:

Khoãng cách tỷ lệ dp giữa 2 độ pha loãng 1:103 và 1:104 dp = % 50 % 50 50 50      L L L = 27 , 27 54 , 54 27 , 27 50   = 0,83 lg LD50 = lgLD < 50 + dp x lgf = -4 + 0,83 x 1 = -3,17

Kết quả trên cho thấy ở độ pha loãng 1:103,17 khi tiêm 0,5 ml gây chết 50 % vịt con thí nghiệm. vậy trong 0,5 ml huyễn dịch virus đặc có chứa 103,17 liều gây chết 50 % trên vịt con thí nghiệm. Vậy 1ml huyễn dịch virus đặc có chứa

5 , 0

4.5 Kết quả khảo sát triệu chứng lâm sàng ở vịt thí nghiệm

Sau khi tiến hành gây nhiễm virus viêm gan vịt type I trên vịt con chúng tôi quan sát và ghi nhận triệu chứng của vịt bệnh và thu được kết quả qua bảng 4.5

Bảng 4.5 Tần suất xuất hiện triệu chứng ở vịt thí nghiệm (n = 25)

Triệu chứng Tần suất xuất hiện triệu chứng theo nghiệm thức Tổng (con) Tỷ lệ % 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

Ít, không đi lại 5 4 4 4 2 19/25 76

Bỏ ăn, ủ rủ 4 3 2 2 1 12/25 48

Khô chân 2 3 2 1 1 9/25 36

Tiêu chảy phân trắng

2 3 2 1 0 8/25 32

Co giật 3 2 2 1 0 8/25 32

Chết ngoẹo đầu 2 1 1 1 0 5/25 20

Chảy nước mũi 1 0 0 1 0 2/25 8

Qua bảng 4.5 ta thấy tần suất xuất hiện triệu chứng ít hoặc không đi lại là cao nhất (76 %), kế đến là bỏ ăn ủ rũ (48 %), khô chân (36 %), tiêu chảy phân trắng (32 %), co giật (32 %), chết ngoẹo đầu (20 %) và thấp nhất là chảy nước mũi (8 %).

Kết quả trên phù hợp với nhận định của Hồ Thị Việt Thu (2012), vịt mắc bệnh viêm gan do virus có triệu chứng ít vận động, buồn ngủ, bỏ ăn sã cánh, một số bị tiêu chảy, sau một vài giờ niêm mạc xanh tím, vịt bị co giật, nằm la liệt nghiêng sườn hoặc nằm ngửa chân duỗi thẳng, đầu ngoẹo sang sườn hoặc lên lưng. Sau đó, vịt co giật rồi chết nhanh, cũng có trường hợp vịt chết mà không có triệu chứng rõ rệt. Theo Nguyễn Phục Hưng (2004), vịt bị nhiễm virus viêm gan vịt type I thường có những dấu hiệu đặc trưng như bỏ ăn ủ rũ, nằm một chổ, sau đó nằm la liệt nghiêng sườn hoặc nằm ngửa, chân thẳng dọc theo thân, đầu ngoẹo lên lưng hoặc sàng một bên.

Hình 4.5 Vịt ít vận động Hình 4.6 Vịt bỏ ăn, ủ rũ

4.6 Kết quả theo dõi tỷ lệ chết ở vịt thí nghiệm

Kết quả ghi nhận số vịt chết trong thời gian thí nghiệm được trình bày