M Ở ĐẦU
2.3.2 Phương pháp nghiên cứu cụ thể
2.3.2.5 Phương pháp lấy chỉ tiêu nông học, thành phần năng suất
Chỉ tiêu nông học
Thời gian sinh trưởng (ngày): Từ khi lúa nẩy mầm cho đến ngày thu hoạch.
Chiều cao cây (cm): Được đo từ mặt đất đến chóp bông của chồi cao nhất.
Chiều dài bông (cm): Đo từ cổ bông đến chóp hạt cuối cùng của bông, đo ngẫu nhiên 3 bông/ bụi và tính trung bình.
Chiều dài từng lóng (cm): Đo khoảng cách giữa 2 đốt lóng liên tiếp nhau và chỉ đo các lóng trên mặt đất. Thứ tự lóng tính từ cổ bông dần xuống gốc, lóng đầu tiên dưới cổ bông là lóng thứ nhất, kế tiếp là lóng thứ 2 và cuối cùng là lóng thứ 4 hoặc thứ 5 và đo 3 chồi/bụi và tính trung bình.
Đường kính lóng (mm): Dùng thước kẹp đo đường kính từng lóng và đo 3 chồi/ bụi và tính trung bình.
Độ cứng lóng thân: Được tiến hành đo bằng máy đo độ cứng IMADA ZP – 50N (Torque gauges IMADA) với độ chính xác ± 0,5% FS.
Các cây tiến hành đo phải lột hết bẹ. Đo khoảng giữa từng lóng.
Hình 2.1 Máy đo độ cứng
Thành phần năng suất
Các thành phần năng suất như: tổng số chồi, số chồi hữu hiệu, số hạt chắc/bông, trọng lượng 1000 hạt.
Tổng số chồi: Đếm tổng số chồi lúc thu hoạch.
Số hạt chắc/ bông (hạt): Đếm tổng số hạt chắc/ bông của 3 bông và tính trung bình.
Trọng lượng 1000 hạt (g): Cân trọng lượng 1000 hạt và quy trọng lượng về độ ẩm chuẩn (14%).
Trong đó:
W0: Trọng lượng mẫu lúc cân. H0: Ẩm độ lúc cân W14%: Trọng lượng hạt ở ẩm độ 14% (g) 86 ) 100 ( 0 0 % 14 H W W
Phần trăm hạt chắc = ) ( ) ( ) ( hat L hat C hat C
2.3.2.5 Phương pháp đánh giá một số chỉ tiêu phẩm chất hạt gạo
Phương pháp phân loại chiều dài và hình dạng hạt gạo (Khush and Paul,
1979)
Để đo chiều dài hạt gạo dùng giấy kẻ li đo nhiều lần. Mỗi dòng lấy 10 hạt gạo.
Bảng 2.2 Phân loại chiều dài và hình dạng hạt gạo (Khush and Pual, 1979)
Kích thước Chiều dài (mm) Cấp Hình dạng hạt Tỉ lệ dài/rộng Cấp
Rất dài >7,5 1 Thon dài >3,0 1
Dài 6,61-7,5 3 Trung bình 2,1-3,0 3
Trung bình 5,51-6,6 5 Bầu 1,1-2,0 5
Ngắn <5,5 7 Tròn <1,0 7
Phân tích hàm lượng amylose hạt lúa theo phương pháp ủa Cagampang và Rodriquez (1980)
Quy trình phân tích hàm lượng amylose theo 4 bước:
Bước 1: Chuẩn bị hóa chất: Ethanol 95%, HCl 30%, NaOH 1N, Iod (Iod 20% + KI 2%)
Bước 2: Ly trích mẫu
Lấy 50 mg nội nhũ đã nghiền mịn cho vào ống 50 ml, thêm 0,5 ml Ethanol 95%, lắc nhẹ cho đều, thêm 9,5 ml NaOH 1N.
Lắc đều và để qua đêm ở nhiệt độ phòng.
Bước 3: Pha loãng mẫu và đo mẫu
Hút 100 l dịch trích cho vào bình định mức 25 ml (đối với mẫu thử - mẫu blank, thay dịch trích bằng 100l NaOH 1N).
Thêm nước cất đến12 bình và lắc đều. Thêm 250 l HCl 30%, lắc đều. Thêm 250 l dung dịch Iod, lắc đều.
Thêm nước cất đến vạch định mức, chuyển sang ống 50 ml và lắc đều trước khi cho vào cuvette, đo độ hấp thụ ở bước sóng 575 nm.
% Amylose 100 5 ,
0
X
Bước 4: Dựng đường chuẩn và tính kết quả Đường chuẩn có dạng Y = aX + b
Trong đó : Y là độ hấp thụ OD
X là lượng amylose có trong mẫu đem đo (mg/ml)
Tính hàm lượng amylose theo công thức:
Đánh giá hàm lượng amylose theo thang đánh giá của IRRI (1988) được trình bày như Bảng 2.3
Bảng 2.3 Phân nhóm lúa theo hàm lượng amylose (IRRI, 1988)
STT Phân nhóm Amylose (%) Cấp độ
1 Nếp 1-2 Rất thấp
2 Dẻo cơm 8-20 Thấp
3 Mền cơm 21-25 Trung bình
4 Cứng cơm >25 Cao
Phân tích hàm lượng protein theo phương pháp Lowry (1993)
Quy trình phân tích hàm lượng protein theo 4 bước:
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch: Dung dịch NaOH 0,1 N
Dung dịch A (Na2CO3 2% + Na-K-tatrate 0,005% + NaOH 0,1 N) Dung dịch B (CuSO4 0,1%)
Dung dịch C (45 ml dung dịch A + 5 ml dung dịch B) Dung dịch Folin 1 N
Bước 2: Ly trích mẫu
Cần 10 mg bột gạo đã nghiền mịn cho vào ống 1,5 ml, thêm vào 1 ml NaOH 0,1 N
Khuấy đều và để qua đêm.
Bước 3: Pha loãng mẫu và đo
14 100 %) 100 ( 10 H m
Hút 100 l dịch trích cho vào ống 10 ml (đối với mẫu thử - mẫu blank, thay dịch trích bằng 100 l NaOH 0,1 N).
Thêm 1 ml nước cất và lắc đều.
Thêm 500 l dung dịch C (chỉ pha trước khi sử dụng 30 phút), lắc đều và để yên trong 10 phút.
Thêm 500 l Folin 1 N, lắc đều và để yên trong 30 phút, cho vào cuvette và đo ở bước sóng 600 nm.
Bước 4: Dựng đường chuẩn và tính kết quả
Pha dung dịch gốc Bovine serum albumin (BSA). Đường chuẩn có dạng:
Y = aX + b
Trong đó: Y là độ hấp thụ OD.
X là lượng protein có trong mẫu đem đo. Hàm lượng protein được tính theo công thức:
Trong đó: H%: Ẩm độ của mẫu
Độ bền gel theo phương pháp của Tang et al. (1991)
Bước 1: Chuẩn bị mẫu
Tách vỏ trấu và đo ẩm độ hạt gạo.
Nghiền mịn và cân mẫu (100 mg với ẩm độ 12%).
Bước 2: Hòa tan mẫu
Thêm 0,2 ml ethanol 95% có chứa 0,025% thymol blue. Thêm 2 ml KOH 0,2 N. Sau đó khuấy đều bằng máy Vortex.
Đậy nắp kỹ và đun trong nồi cách thủy (nhiệt độ là 1000C) khoảng 5 phút.
Lấy ra, để yên trong 5 phút và sau đó làm lạnh trong nồi nước đá 10 phút.
Bước 3: Đọc và ghi kết quả
Để ống nghiệm nằm ngang trên bề mặt bằng phẳng, để gel chảy từ từ và sau một giờ thì tiến hành đo chiều dài thể gel (từ đáy đến mí trên của thể gel).
% Protein 100
m X
Đánh giá độ bền thể gel theo thang điểm của IRRI (1998) ở Bảng 2.4.
Bảng 2.4 Phân cấp độ bền thể gel (IRRI, 1998)
Cấp Chiều dài thể gel (mm) Loại độ bền thể gel
1 80 - 100 Rất mềm
3 61 - 81 Mềm
5 41 - 60 Trung bình
7 35 - 40 Cứng
9 < 35 Rất cứng
Nhiệt trở hồ theo phương pháp của Jennings et al. (1979)
Chuẩn bị hai mẫu cho mỗi giống được thử. Mỗi mẫu lấy 6 hạt gạo, cạo sạch lớp cám, chọn hạt không bị nứt, để vào đĩa petri.
Thêm 10 ml KOH 1,7 % vào mỗi đĩa.
Sắp xếp các hạt dang đều ra để mỗi hạt có đủ chổ nở lan ra. Đậy đĩa petri lại và để yên khoảng 23 giờ ở nhiệt độ phòng.
Đánh giá độ lan rộng và độ trong suốt của hạt gạo theo thang điểm của IRRI (1979) được trình bày ở bảng 2.5.
Bảng 2.5 Bảng phân cấp nhiệt trở hồ (IRRI, 1979)
Cấp Độ lan rộng Độ trở hồ
1 Hạt gạo còn nguyên. Cao
2 Hạt gạo phòng lên. Cao
3 Hạt gạo phòng lên, viền còn nguyên hay rõ nét. Cao 4 Hạt gạo phòng lên, viền còn nguyên và nở rộng. Trung bình 5 Hạt rã ra, viền hoàn toàn nở rộng. Trung bình
6 Hạt tan ra hòa chung với viền. Thấp
Cấp trở hồ N n xi
Cấp trung bình sẽ được tính theo công thức:
Trong đó: xi là cấp độ trở hồ.
n là số hạt có cấp độ trở hồ xi
N là số hạt thử nghiệm.
2.3.2.4 Phương pháp trắc nghiệm tính kháng rầy
Trắc nghiệm tính kháng rầy bằng phương pháp hộp mạ theo IRRI (1996)
Các dòng được chọn sau khi đã ngâm ủ được giao theo hàng trong khây nhựa đã chuẩn bị sẵn với giống TN1 làm chuẩn nhiễm và BN2 làm chuẩn kháng. Khi mạ được 2-3 lá tiến hành thả rầy tuổi 1 đến tuổi 2 vào với mật độ 4- 6 con/cây, sau khi thả rầy từ 7-10 ngày, đánh giá hộp mạ khi giống chuẩn nhiễm TN1 cháy rụi ở cấp 9 (theo thang đánh giá của IRRI, 1996 được trích dẫn bởi Lê Xuân Thái và ctv., 2012).
Bảng 2.6 Đánh giá khả năng kháng rầy bằng phương pháp hộp mạ theo IRRI (1996)
Cấp Mô tả Đánh giá
0 Không bị thiệt hại Rất kháng
1 Vài cây hơi vàng Kháng
3 Lá vàng nhưng chưa cháy rầy Hơi kháng
5 Lá vàng, một vài cây chết và có 10-15% chồi bị cháy rầy, các
chồi khác lùn Hơi nhiễm
7 Hơn ½chồi bị chết hay cháy rầy, cây còn lại lùn Nhiễm
9 Tất cả các cây đều chết Rất nhiễm
2.3.2.4 Phương pháp điện di protein tổng số theo phương pháp SDS-PAGE (Sodium Doecyl Sulfat Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
Quy trình gồm 6 bước:
Bước 1:Chuẩn bị dung dịch
Dung dịch ly trích: Kit L (Tris HCl 0,05 M (pH = 8) + SDS 0,02 % + Ure 5 M) và 2-Mercaptoethanol (2-ME) 1%.
Dung dịch làm gel A: Tris HCl 3 M (pH = 8,5), SDS 0,4%. Dung dịch làm gel B: Tris HCl (pH = 6,5), SDS 0,4%.
Dung dịch làm gel C: Acrylamide 29,2%, bis Acrylamide 0,8% thêm nước cất đến 100 ml.
Dung dịch đệm điện di: Tris HCl 0,025%, Glycine 0,192 M và SDS 0,125%.
Thuốc nhộm: 0,225 M Coomassie Brilliant Blue R 250 (CBBR-250) trong Methanol 0,225 M, acid acetic, nước cất theo tỉ lệ 44:0,6:50.
Bước 2:Ly trích mẫu
Nghiền mịn nội nhũ và cân lấy 3 mg cho vào ống tuýp 1,5 ml. Thêm 100 µl dung dịch ly trích.
Lắc ít nhất trong 3 giờ hoặc để qua đêm. Ly tâm 1400 vòng/phút trong 3 phút.
Bước 3:Làm gel
Tùy theo chiều dài, rộng và độ dày của khuông làm gel mà thể tích mỗi gel thay đổi. Sau khi tính được thể tích và phần trăm gel cần có, tra bảng tương quan giữa phần trăm gel và lượng các hóa chất cần để xác định thể tích các dung dịch.
Làm gel phân tách 12% Polyacrylmide và gel cô mẫu 5% Polyacrylamide theo quy trình của Smbrook (1898).
Làm gel phân tách 12% Polyacrylamide:
Lắp kính bộ gel, trộn dung dịch acrylamide A, C + nước trong cốc nhỏ, thêm AP,TEMD và khuấy đều cho vào gel
Thêm 2 giọt nước trên bề mặt dung dịch gel, để yên 30-60 phút gel sẽ đông.
Làm gel cô mẫu 5% Polyacrylamide:
Loại bỏ lớp nước trên bề mặt gel phân tách, trộn dung dịch B, C + nước trong cốc nhỏ, thêm AP, TEMED và khuấy đều và cho gel.
Cài lược giữa hai tấm kính của gel để tạo giếng, thêm 1 giọt nước, để yên 30-60 phút, loại bỏ răng lược, lắp vào khung điện di và cho dung dịch đệm điện di vào ngập các giếng gel.
Bảng 2.7 Công thức pha dung dịch tạo gel
Bước 4:Tiến hành điện di
Bơm 10 µl dung dịch đã ly trích mẫu/giếng.
Chạy điện di với hiệu điện thế 20 V ở gel cô mẫu và 40 V ở gel phân tách.
Bước 5:Nhộm và rữa gel
Gel được nhộm trong 2 giờ bằng dung dịch thuốc nhuộm CBBR-250. Rửa gel trong microwave trong 30 phút.
Bước 6: Đọc kết quả, scan gel lại và bảo quản mẫu gel với 1 ít nước.
2.3.2.5 Phương pháp xử lý số liệu tính giá trị trung bình bằng phần mềm Microsoft Excel.
Hóa chất (1gel) Gel phân tách 12 % (ml) Gel cô mẫu 5 %(ml)
Nước cất Acrylamide 30 % Dung dịch Tris 1 Dung dịch Tris 2 SDS 10 % AP 10 % TEMED 1.6 2.0 1.3 - 1.1 0.05 0.002 0.68 0.17 - 0.13 0.03 0.01 0.001
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ LAI TẠO
Các hạt cha mẹ được trồng riêng biệt trong từng chậu và tiến hành lai tạo khi bắt đầu trổ hoa. Kết quả lai tạo thu được 8 hạt và được quy ước là THL19. Trong quá trình lai do hoa lúa nhỏ, trong quá trình khử đực và thụ phấn có thể làm cho hoa bị tổn thương. Hạt lai thu được xấu hơn hạt bình thường.
3.2 THẾ HỆ F1
Các hạt lai F1 và cây cha mẹ được trồng riêng biệt trong từng chậu và cùng thời gian, để tiện theo dõi, so sánh chỉ tiêu nông học và thành phần năng suất. Do hạt F1 khá ít và trong quá trình trồng và chăm sóc do ảnh hưởng của thời tiết sâu bệnh… nên thu được 3 cá thể đạt chỉ tiêu mong muốn. Sau đó tiến hành tách vỏ trấu của 3 cá thể được chọn thấy được sự phân ly rõ rệt giữa gạo và nếp (Hình 3.1). Do mục tiêu đề tài nhằm cải thiện chất lượng gạo theo hướng mềm cơm nên đã loại bỏ phần hạt nếp. Các hạt gạo còn lại gôm chung, được ký hiệu là THL19-01 tiếp tục trồng và theo dõi ở vụ sau.
Hình 3.1 Hạt của thế hệ F1
3.2.1 Chỉ tiêu nông học và thành phần năng suất của cây thế hệ F1
Bảng 3.1 Một số chỉ tiêu nông học và thành phần năng suất của cây thế hệ F1 (giá trị
trung bình của 3 cá thể) so với cha mẹ
STT Chỉ tiêu IR50404 NK2 x Nhật TBF1
1 TGST (ngày) 85 91 91
2 Cao cây (cm) 90 115 100
3 Số bông/bụi 20 24 26
4 Tỉ lệ hạt chắc (%) 65 64 62
TGST: Thời gian sinh trưởng , TBF1: Trung bình các cá thể F1
Thời gian sinh trưởng của cây F1 trung bình là 91 ngày không khác biệt nhiều so với dòng nếp NK2 x Nhật (91 ngày) và IR50404 (85 ngày) trồng đối chứng. Theo Yosida (1972) (được biện dịch bởi Trần Minh Thành, 1981), các giống lúa có thời gian sinh trưởng khoảng 90 ngày, nếu cấy khoảng 100 ngày là ngắn nhất, hợp lý nhất để đạt nâng suất cao. Với đặc điểm này thì các THL19 bước đầu được đánh giá là đã đạt được một trong các tiêu chí về giống có tiềm năng về nâng suất cao.
Chiều cao cây
Chiều cao cây được tính từ gốc đến đỉnh bông lúa cao nhất của bụi. Kết quả cho thấy chiều cao của cây F1 trung bình là 100 cm, cao hơn giống IR50404 (90 cm) nhưng lại thấp hơn dòng nếp NK2 x Nhật (115 cm). Điều này đã thể hiện đặc tính trung gian giữa cây cha mẹ.
Số bông trên bụi và tỷ lệ hạt chắc
Số bông trên bụi trung bình của các cây F1 là 26 bông cao hơn số bông trên bụi của cả hai giống ban đầu. Từ đó cho thấy, các cây F1 thể hiện ưu thế lai, đồng thời cải thiện cải thiện được số bông trên bụi của giống IR50404 góp phần gia tăng năng suất. Tỷ lệ hạt chắc trung bình của các cây của F1 là 64% không chênh lệch nhiều so với giống IR50405 (65%). Từ đó, cho thấy con lai biểu hiện đặc tính vượt trội hơn giống IR50404đáp ứng mục tiêu đề tài.
3.3 THẾ HỆ F
Đây là thế hệ các cá thể có mức độ phân ly di truyền cao, có ý nghĩa quan trọng trong công tác chọn giống. Các hạt F2 thu từ cây F1, lấy các hạt gạo còn lại, chọn những hạt gạo nào không bạc bụng đem trồng trong nhà lưới, theo dõi về sự phân ly về chỉ tiêu nông học, ghi nhận đánh giá, kết hợp chọn cá thể có chỉ tiêu nông học theo hướng năng suất cao: nẩy chồi tốt, thời gian sinh trưởng ngắn, thấp cây. Ở thế hệ F2 ta chọn khoảng 20 cá thể để tách dòng.
Kết quả ta chọn được 18 các thể có kiểu hình đẹp (nẩy chồi tốt, thấp cây) và thời gian sinh trưởng ngắn.
3.3.1 Các chỉ tiêu nông học và thành phần năng suất của các dòng ở thế
hệ F2
Thời gian sinh trưởng
Thời gian sinh trưởng của các dòng ở thế hệ F2 trung bình 90 ngày, biến thiên từ 87-92 ngày và biến động không lớn so với cây cha mẹ (bảng 3.2). Trong đó, THL19-01-03, THL19-01-10, THL19-01-13 có thời gian sinh trưởng ngắn nhất là 87 ngày và cao nhất là 92 ngày ở THL19-01-04, THL19-01-07, THL19-01-08, THL19-01-14, THL19-01-018. Theo Nguyễn Thành Hối (2008), thì cây lúa có thời gian sinh trưởng từ 90-105 ngày thuộc nhóm ngắn
ngày (nhóm A1). Kết quả cho thấy các dòng ở thế hệ F2 mang đặc tính trung gian giữa dòng nếp NK2 x Nhật và giống IR50404 và đều thuộc nhóm ngắn ngày.
Chiều cao cây
Kết quả đánh giá chiều cao cây của các dòng ở thế hệ F2 được trình bày qua bảng 3.2 cho thấy đặc tính chiều cao cây phân ly ở thế hệ F2. Chiều cao cây ở thế hệ F2 biến thiên từ 87-112 cm. Trong đó, THL19-01-16 có chiều cao cây