PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG LÚA

M Ở ĐẦU

1.6 PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG LÚA

Có nhiều phương pháp cải tiến giống lúa. Tùy mục đích, cơ sở vật chất và phương tiện chúng ta sẵn có mà ta quyết định sử dụng phương pháp cải tiến giống lúa nào thích hợp.

1.6.1 Chọn lọc cá thể hoặc chọn lọc dòng thuần

Chọn lọc cá thể là chọn lọc cá thể ưu tú, đem trồng và cho tự thụ phấn qua nhiều thế hệ. Một giống được chọn bằng phương pháp chọn lọc cá thể sẽ đồng đều hơn một giống được tạo ra bằng phương pháp chọn lọc quần thể, vì tất cả các cây trồng cùng một dòng thuần đều có cùng một kiểu gen (với giả định cá thể được chọn ban đầu phải đồng hợp tử ở tất cả các locus) (Nguyễn Phước Đằng, 2010).

1.6.2 Lai tạo

Lai tạo nhằm tạo ra những biến động di truyền mới và tái tổ hợp các gen mong muốn bằng cách lai giống nhân tạo. Các dòng lai sau đó được cho tự thụ và chọn lọc theo nhiều kiểu khác nhau. Có nhiều phương pháp lai tạo để cải thiện giống lúa, tùy mục đích, cơ sở vật chất mà ta quyết định phương pháp nào thích hơp (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008).

 Lai đơn

Lai giữa hai giống cha và mẹ một lần A/B hoặc A*B trong đó tên giống mẹ được viết trước và tên giống cha được viết sau (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008). Người ta tiến hành lai giữa hai bố mẹ có tính trạng bổ sung. Đây là phương pháp sử dụng rộng rãi vì bố mẹ được nghiên cứu tỉ mỉ thông qua các tính trạng. Lai đơn có thể tiến hành trong loài (lai gần), nhưng cũng có thể thực hiện phép lai khác loài phụ hoặc khác loài (lai xa).

1.7 MỤC TIÊU CHỌN TẠO GIỐNG

Theo Nguyễn Ngọc Đệ (2008), công tác cải tiến giống lúa bao gồm 4 mục tiêu:

 Giống lúa mới phải có năng suất cao hơn giống cũ trong cùng điều kiện mùa vụ, đất đai và chế độ canh tác.

 Giống mới phải có chất lượng hơn giống cũ, được mọi người ưa chuộng có giá trị dinh dưỡng cao hơn, chất lượng nấu nướng cao hơn.

 Giống mới phải thích ứng tốt hơn với điều kiện khí hậu, đất đai, tập quán canh tác, hệ thống luân canh của những vùng nhất định.

 Giống mới có khả năng kháng lại các loại sâu hại chính của từng vùng, từng vụ mà giống đó gieo trồng.

Ngoài ra, các nhà chọn giống còn dựa vào đặc tính hình thể, kiểu cây lúa để chọn ra giống lúa thích hợp. Sau đây là 6 đặc tính về kiểu hình cây lúa lý tưởng, cho năng suất cao:

 Có đủ số hạt cần thiết trên đơn vị diện tích.

 Có thân thấp, bông ngăn để chống đổ ngã và tăng phần trăm hạt chắc.  Có 3 lá trên cùng ngắn, dày và thẳng đứng để gia tăng hiệu quả sử dụng ánh sáng và do đó tăng phần trăm hạt chắc.

 Giữ được khả năng hấp thụ đạm ngay cả thời kỳ sau khi trổ.  Có càng nhiều lá xanh trên chồi càng tốt.

 Trổ vào lúc thời tiết tốt, nhiều nắng ít nhất cho đến 25 ngày sau khi trổ để gia tăng sản phẩm quang hợp.

CHƯƠNG 2

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM

Thời gian:từ tháng 03 năm 2012 đến tháng 12 năm 2013

Địa điểm: Phòng thí nghiệm Di truyền - Chọn giống và Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học, Bộ môn Di Truyền Giống - Nông Nghiệp, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ.

2.2 PHƯƠNG TIỆN

2.2.1 Vật liệu nghiên cứu

Giống lúa:

 Giống IR50404 (thuần) làm cây mẹ.

 Dòng 5 (Nếp NK2 x Lúa Nhật, cây F4) (chưa thuần) làm cây cha.

Bảng 2.1 Giới thiệu vật liệu nghiên cứu

Giống /

dòng Nguồn gốc Đặc tính

IR50404

Giống lúa IR50404 được cung cấp từ Phòng thí nghiệm Di truyền - Chọn giống và Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học, Bộ môn Di Truyền Giống - Nông Nghiệp, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ.

Thời gian sinh trưởng: 85 – 90 ngày. - Chiều cao cây: 85 – 90 cm.

- Trọng lượng 1000 hạt: 22 – 23 gram. - Năng suất: vụ Đông Xuân 6-8 tấn/ha, vụ Hè Thu 5-6 tấn/ha.

- Hơi nhiễm rầy nâu, nhiễm đạo ôn. - Yếu rạ

- Đây là giống lúa dễ canh tác, nâng suất cao tuy nhiên chất lượng gạo kém, cứng cơm, hạt gạo đục ở vụ Hè-Thu.

(NK2 x Nhật)

( NK2 x Nhật ) do Bộ môn Di truyền-Giống Nông nghiệp thuộc Khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ chọn tạo từ tổ hợp lai của giống Nếp NK2 và Lúa Nhật.

- Thời gian sinh trưởng: 90 – 95 ngày. - Chiều cao cây: 110 – 130 cm. - Trọng lượng 1000 hạt: 25 - 26 gram. - Năng suất: 5 - 6 tấn/ha.

- Nhiễm rầy .

- Đặc biệt gạo mềm cơm và cứng cây, ngắn ngày

2.2.2 Vật liệu, dụng cụ và hóa chất thí nghiệm

Hóa chất thí nghiệm: Tris, Acrylamine, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), TEMED,Coomassie Brilliant Blu R250,2-Mercapto ethanol (2-ME), KOH, HCL, Iot,…..

Dụng cụ thí nghiệm: Bộ nguồn chạy điện di, khung chạy điện di, kính chạy điện di dạng mini, máy li tâm, cân điện tử, cân phân tích, máy scan….

Dụng cụ lai tạo: panh, kéo, giấy bóng mờ, kẹp,…

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Nội dung nghiên cứu

Bước 1: Nhận giống và trồng cây cha mẹ.

Bước 2: Thực hiện tổ hợp lai và thu cây hạt lai F1.

Bước 3: Trồng cây F1 ( trông nhà lưới), thu cá thể.

Bước 4: Trồng cây F2 (trong nhà lưới), theo dõi sự phân ly và thu chọn các cá thể ưu tú. Đánh giá các chỉ tiêu nông học, chọn dòng theo hướng nâng suất cao, kháng rầy.

Bước 5: Trồng cây F3 (trong nhà lưới), thu thành từng dòng. Phân tích các chỉ tiêu nông học và phẩm chất hạt (amylose, protein,…).

Bước 6: Đánh giá khả năng chống đổ ngã và chống sâu bệnh (trắc nghiệm rầy).

Bước 7: Điện di hạt F4 để kiểm tra độ thuần.

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu cụ thể

2.3.2.5 Phương pháp lấy chỉ tiêu nông học, thành phần năng suất

Chỉ tiêu nông học

 Thời gian sinh trưởng (ngày): Từ khi lúa nẩy mầm cho đến ngày thu hoạch.

 Chiều cao cây (cm): Được đo từ mặt đất đến chóp bông của chồi cao nhất.

 Chiều dài bông (cm): Đo từ cổ bông đến chóp hạt cuối cùng của bông, đo ngẫu nhiên 3 bông/ bụi và tính trung bình.

 Chiều dài từng lóng (cm): Đo khoảng cách giữa 2 đốt lóng liên tiếp nhau và chỉ đo các lóng trên mặt đất. Thứ tự lóng tính từ cổ bông dần xuống gốc, lóng đầu tiên dưới cổ bông là lóng thứ nhất, kế tiếp là lóng thứ 2 và cuối cùng là lóng thứ 4 hoặc thứ 5 và đo 3 chồi/bụi và tính trung bình.

 Đường kính lóng (mm): Dùng thước kẹp đo đường kính từng lóng và đo 3 chồi/ bụi và tính trung bình.

 Độ cứng lóng thân: Được tiến hành đo bằng máy đo độ cứng IMADA ZP – 50N (Torque gauges IMADA) với độ chính xác ± 0,5% FS.

 Các cây tiến hành đo phải lột hết bẹ.  Đo khoảng giữa từng lóng.

Hình 2.1 Máy đo độ cứng

Thành phần năng suất

Các thành phần năng suất như: tổng số chồi, số chồi hữu hiệu, số hạt chắc/bông, trọng lượng 1000 hạt.

 Tổng số chồi: Đếm tổng số chồi lúc thu hoạch.

 Số hạt chắc/ bông (hạt): Đếm tổng số hạt chắc/ bông của 3 bông và tính trung bình.

 Trọng lượng 1000 hạt (g): Cân trọng lượng 1000 hạt và quy trọng lượng về độ ẩm chuẩn (14%).

Trong đó:

W0: Trọng lượng mẫu lúc cân. H0: Ẩm độ lúc cân W14%: Trọng lượng hạt ở ẩm độ 14% (g) 86 ) 100 ( 0 0 % 14 H W W   

Phần trăm hạt chắc = ) ( ) ( ) ( hat L hat C hat C 

2.3.2.5 Phương pháp đánh giá một số chỉ tiêu phẩm chất hạt gạo

Phương pháp phân loại chiều dài và hình dạng hạt gạo (Khush and Paul,

1979)

Để đo chiều dài hạt gạo dùng giấy kẻ li đo nhiều lần. Mỗi dòng lấy 10 hạt gạo.

Bảng 2.2 Phân loại chiều dài và hình dạng hạt gạo (Khush and Pual, 1979)

Kích thước Chiều dài (mm) Cấp Hình dạng hạt Tỉ lệ dài/rộng Cấp

Rất dài >7,5 1 Thon dài >3,0 1

Dài 6,61-7,5 3 Trung bình 2,1-3,0 3

Trung bình 5,51-6,6 5 Bầu 1,1-2,0 5

Ngắn <5,5 7 Tròn <1,0 7

Phân tích hàm lượng amylose hạt lúa theo phương pháp ủa Cagampang và Rodriquez (1980)

Quy trình phân tích hàm lượng amylose theo 4 bước:

Bước 1: Chuẩn bị hóa chất: Ethanol 95%, HCl 30%, NaOH 1N, Iod (Iod 20% + KI 2%)

Bước 2: Ly trích mẫu

 Lấy 50 mg nội nhũ đã nghiền mịn cho vào ống 50 ml, thêm 0,5 ml Ethanol 95%, lắc nhẹ cho đều, thêm 9,5 ml NaOH 1N.

 Lắc đều và để qua đêm ở nhiệt độ phòng.

Bước 3: Pha loãng mẫu và đo mẫu

 Hút 100 l dịch trích cho vào bình định mức 25 ml (đối với mẫu thử - mẫu blank, thay dịch trích bằng 100l NaOH 1N).

 Thêm nước cất đến12 bình và lắc đều.  Thêm 250 l HCl 30%, lắc đều.  Thêm 250 l dung dịch Iod, lắc đều.

 Thêm nước cất đến vạch định mức, chuyển sang ống 50 ml và lắc đều trước khi cho vào cuvette, đo độ hấp thụ ở bước sóng 575 nm.

% Amylose 100 5 ,

0 

 X

Bước 4: Dựng đường chuẩn và tính kết quả Đường chuẩn có dạng Y = aX + b

Trong đó : Y là độ hấp thụ OD

X là lượng amylose có trong mẫu đem đo (mg/ml)

Tính hàm lượng amylose theo công thức:

Đánh giá hàm lượng amylose theo thang đánh giá của IRRI (1988) được trình bày như Bảng 2.3

Bảng 2.3 Phân nhóm lúa theo hàm lượng amylose (IRRI, 1988)

STT Phân nhóm Amylose (%) Cấp độ

1 Nếp 1-2 Rất thấp

2 Dẻo cơm 8-20 Thấp

3 Mền cơm 21-25 Trung bình

4 Cứng cơm >25 Cao

Phân tích hàm lượng protein theo phương pháp Lowry (1993)

Quy trình phân tích hàm lượng protein theo 4 bước:

Bước 1: Chuẩn bị dung dịch:  Dung dịch NaOH 0,1 N

 Dung dịch A (Na2CO3 2% + Na-K-tatrate 0,005% + NaOH 0,1 N)  Dung dịch B (CuSO4 0,1%)

 Dung dịch C (45 ml dung dịch A + 5 ml dung dịch B)  Dung dịch Folin 1 N

Bước 2: Ly trích mẫu

 Cần 10 mg bột gạo đã nghiền mịn cho vào ống 1,5 ml, thêm vào 1 ml NaOH 0,1 N

 Khuấy đều và để qua đêm.

Bước 3: Pha loãng mẫu và đo

14 100 %) 100 ( 10     H m

 Hút 100 l dịch trích cho vào ống 10 ml (đối với mẫu thử - mẫu blank, thay dịch trích bằng 100 l NaOH 0,1 N).

 Thêm 1 ml nước cất và lắc đều.

 Thêm 500 l dung dịch C (chỉ pha trước khi sử dụng 30 phút), lắc đều và để yên trong 10 phút.

 Thêm 500 l Folin 1 N, lắc đều và để yên trong 30 phút, cho vào cuvette và đo ở bước sóng 600 nm.

Bước 4: Dựng đường chuẩn và tính kết quả

Pha dung dịch gốc Bovine serum albumin (BSA). Đường chuẩn có dạng:

Y = aX + b

Trong đó: Y là độ hấp thụ OD.

X là lượng protein có trong mẫu đem đo. Hàm lượng protein được tính theo công thức:

Trong đó: H%: Ẩm độ của mẫu

Độ bền gel theo phương pháp của Tang et al. (1991)

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

 Tách vỏ trấu và đo ẩm độ hạt gạo.

 Nghiền mịn và cân mẫu (100 mg với ẩm độ 12%).

Bước 2: Hòa tan mẫu

 Thêm 0,2 ml ethanol 95% có chứa 0,025% thymol blue.  Thêm 2 ml KOH 0,2 N. Sau đó khuấy đều bằng máy Vortex.

 Đậy nắp kỹ và đun trong nồi cách thủy (nhiệt độ là 1000C) khoảng 5 phút.

 Lấy ra, để yên trong 5 phút và sau đó làm lạnh trong nồi nước đá 10 phút.

Bước 3: Đọc và ghi kết quả

 Để ống nghiệm nằm ngang trên bề mặt bằng phẳng, để gel chảy từ từ và sau một giờ thì tiến hành đo chiều dài thể gel (từ đáy đến mí trên của thể gel).

% Protein  100

m X

Đánh giá độ bền thể gel theo thang điểm của IRRI (1998) ở Bảng 2.4.

Bảng 2.4 Phân cấp độ bền thể gel (IRRI, 1998)

Cấp Chiều dài thể gel (mm) Loại độ bền thể gel

1 80 - 100 Rất mềm

3 61 - 81 Mềm

5 41 - 60 Trung bình

7 35 - 40 Cứng

9 < 35 Rất cứng

Nhiệt trở hồ theo phương pháp của Jennings et al. (1979)

 Chuẩn bị hai mẫu cho mỗi giống được thử. Mỗi mẫu lấy 6 hạt gạo, cạo sạch lớp cám, chọn hạt không bị nứt, để vào đĩa petri.

 Thêm 10 ml KOH 1,7 % vào mỗi đĩa.

 Sắp xếp các hạt dang đều ra để mỗi hạt có đủ chổ nở lan ra.  Đậy đĩa petri lại và để yên khoảng 23 giờ ở nhiệt độ phòng.

Đánh giá độ lan rộng và độ trong suốt của hạt gạo theo thang điểm của IRRI (1979) được trình bày ở bảng 2.5.

Bảng 2.5 Bảng phân cấp nhiệt trở hồ (IRRI, 1979)

Cấp Độ lan rộng Độ trở hồ

1 Hạt gạo còn nguyên. Cao

2 Hạt gạo phòng lên. Cao

3 Hạt gạo phòng lên, viền còn nguyên hay rõ nét. Cao 4 Hạt gạo phòng lên, viền còn nguyên và nở rộng. Trung bình 5 Hạt rã ra, viền hoàn toàn nở rộng. Trung bình

6 Hạt tan ra hòa chung với viền. Thấp

Cấp trở hồ N n xi   

Cấp trung bình sẽ được tính theo công thức:

Trong đó: xi là cấp độ trở hồ.

n là số hạt có cấp độ trở hồ xi

N là số hạt thử nghiệm.

2.3.2.4 Phương pháp trắc nghiệm tính kháng rầy

Trắc nghiệm tính kháng rầy bằng phương pháp hộp mạ theo IRRI (1996)

Các dòng được chọn sau khi đã ngâm ủ được giao theo hàng trong khây nhựa đã chuẩn bị sẵn với giống TN1 làm chuẩn nhiễm và BN2 làm chuẩn kháng. Khi mạ được 2-3 lá tiến hành thả rầy tuổi 1 đến tuổi 2 vào với mật độ 4- 6 con/cây, sau khi thả rầy từ 7-10 ngày, đánh giá hộp mạ khi giống chuẩn nhiễm TN1 cháy rụi ở cấp 9 (theo thang đánh giá của IRRI, 1996 được trích dẫn bởi Lê Xuân Thái và ctv., 2012).

Bảng 2.6 Đánh giá khả năng kháng rầy bằng phương pháp hộp mạ theo IRRI (1996)

Cấp Mô tả Đánh giá

0 Không bị thiệt hại Rất kháng

1 Vài cây hơi vàng Kháng

3 Lá vàng nhưng chưa cháy rầy Hơi kháng

5 Lá vàng, một vài cây chết và có 10-15% chồi bị cháy rầy, các

chồi khác lùn Hơi nhiễm

7 Hơn ½chồi bị chết hay cháy rầy, cây còn lại lùn Nhiễm

9 Tất cả các cây đều chết Rất nhiễm

2.3.2.4 Phương pháp điện di protein tổng số theo phương pháp SDS-PAGE (Sodium Doecyl Sulfat Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

Quy trình gồm 6 bước:

Bước 1:Chuẩn bị dung dịch

 Dung dịch ly trích: Kit L (Tris HCl 0,05 M (pH = 8) + SDS 0,02 % + Ure 5 M) và 2-Mercaptoethanol (2-ME) 1%.

 Dung dịch làm gel A: Tris HCl 3 M (pH = 8,5), SDS 0,4%.  Dung dịch làm gel B: Tris HCl (pH = 6,5), SDS 0,4%.

 Dung dịch làm gel C: Acrylamide 29,2%, bis Acrylamide 0,8% thêm nước cất đến 100 ml.

 Dung dịch đệm điện di: Tris HCl 0,025%, Glycine 0,192 M và SDS 0,125%.

 Thuốc nhộm: 0,225 M Coomassie Brilliant Blue R 250 (CBBR-250) trong Methanol 0,225 M, acid acetic, nước cất theo tỉ lệ 44:0,6:50.

Bước 2:Ly trích mẫu

 Nghiền mịn nội nhũ và cân lấy 3 mg cho vào ống tuýp 1,5 ml.  Thêm 100 µl dung dịch ly trích.

 Lắc ít nhất trong 3 giờ hoặc để qua đêm.  Ly tâm 1400 vòng/phút trong 3 phút.

Bước 3:Làm gel

Tùy theo chiều dài, rộng và độ dày của khuông làm gel mà thể tích mỗi gel thay đổi. Sau khi tính được thể tích và phần trăm gel cần có, tra bảng tương quan giữa phần trăm gel và lượng các hóa chất cần để xác định thể tích các dung dịch.

Làm gel phân tách 12% Polyacrylmide và gel cô mẫu 5% Polyacrylamide theo quy trình của Smbrook (1898).

Làm gel phân tách 12% Polyacrylamide:

 Lắp kính bộ gel, trộn dung dịch acrylamide A, C + nước trong cốc nhỏ, thêm AP,TEMD và khuấy đều cho vào gel

 Thêm 2 giọt nước trên bề mặt dung dịch gel, để yên 30-60 phút gel sẽ đông.

Làm gel cô mẫu 5% Polyacrylamide:

 Loại bỏ lớp nước trên bề mặt gel phân tách, trộn dung dịch B, C + nước trong cốc nhỏ, thêm AP, TEMED và khuấy đều và cho gel.