3.3.1 Đối tượng.
Mẫu được lấy ngẫu nhiên ở chuột gồm 126 mẫu, trong đó có 54 chuột cống và 72 chuột đồng từ Long Xuyên, Tịnh Biên và Tân Châu của tỉnh An Giang.
3.3.2 Thiết bị, dụng cụ
Thiết bị: Máy ly tâm, tủ sấy, tủ lạnh, tủ ấm, kính hiển vi tụ quang nền đen,...
Dụng cụ: ống tiêm, tupe serum, ống eppendorf, micropipet và đầu cone tương ứng, ống nghiệm, đĩa nhựa 96 giếng,...
Hoá chất
Dung dịch muối đệm phosphat (PBS) - Dung dịch đậm đặc 10 lần:
Na2HPO4 khan 12,36 g NaH2PO4.H2O 1,80 g NaCl 85,00 g Nước vừa đủ 1000 ml
- Dung dịch dùng trong phản ứng ngưng kết trên phiến kính (PBS) 0,01 M, pH 7,6.
Dung dịch đậm đặc 100 ml Nước vừa đủ 1000 µl
Kháng nguyên chuẩn dùng chẩn đoán Leptospira là kháng nguyên sống gồm 24 chủng Leptospira do viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh cung cấp.
Bảng 3.1: Kháng nguyên sử dụng trong phản ứng vi ngưng kết MAT Table 3
Stt Serogroup Serovar Chủng
1 Australis australis Ballico
2 Autumnalis autumnalis Akiyami A
3 Bataviae bataviae Van Tienen
4 Canicola canicola Hond Utrecht IV
5 Ballum castellonis Castellon 3
6 Icterohaemorrhagiae copenhageni Wijnberg
7 Pyrogenes pyrogenes Salinem
8 Icterohaemorrhagiae tonkini LT 96 68
9 Icterohaemorrhagiae icterohaemorrhagiae Verdun
10 Cynopterie cynopterie 3522 C
11 Gryppotyphosa gryppotyphosa Moskva V
12 Sejroe hardjo Hardjo Bovis
13 Hebdomadis hebdomadis Hebdomadis
14 Javanica javanica Veldrat Bataviae 46
15 Panama panama CZ 214K
16 Semaranga patoc Patoc 1
17 Pomona pomona Pomona
18 Tarassovi tarassovi Mitis Johnson
19 Tarassovi vughia LT 09 68
20 Sejroe hardjo Hardjoprajitno
21 Sejroe saxkoebing Mus 24
22 Canicola canicola Chiffon
23 Louisiana louisiana LSU 1945
3.4 Phương pháp tiến hành 3.4.1 Phương pháp lấy mẫu. 3.4.1 Phương pháp lấy mẫu.
- Mang bao tay bảo hộ dày khi bắt chuột ra khỏi lồng để tránh bị chuột cắn, dùng ống tiêm lấy máu từ tĩnh mạch đuôi hay từ tim khoảng 2 – 2,5ml/con.
Hình 3.1 Cách lấy máu chuột Figure 4
- Cho máu vào ống không chứa chất kháng đông. Mẫu máu sau khi lấy được trữ trong thùng đá đem về ly tâm.
- Trích huyết thanh cho vào ống eppendorf được bảo quản lạnh ở nhiệt độ 2-8oC, nếu kiểm tra trong vài ngày, nếu trữ mẫu lâu phải bảo quản tủ đông (-20oC).
3.4.2 Phương pháp thực hiện phản ứng vi ngưng kết (MAT: Microscopic Agglutination Test) Agglutination Test)
Nguyên lý: Khi thú nhiễm Leptospira, trong máu sẽ xuất hiện kháng thể đặc
hiệu. Phản ứng vi ngưng kết (MAT) dựa trên sự ngưng kết giữa kháng nguyên với kháng thể khi trộn với nhau sau một thời gian ủ. Sự ngưng kết được xem dưới kính hiển vi tụ quang nền đen.
Chuột Kháng nguyên
Lấy mẫu máu
Chiết lấy huyết thanh
Pha loãng huyết thanh ở 1/10 Pha loãng kháng nguyên
Phản ứng MAT
Kết quả phản ứng MAT ở 1/20
Âm tính Dương tính
Mức ngưng kết 1+ Mức ngưng kết >=2+
Nâng cao hiệu giá
Thực hiện phản ứng MAT
Hình 3.2 Sơ đồ chẩn đoán huyết thanh học Leptospirosis Figure 5
Các bước tiến hành phản ứng Bước 1 Chuẩn bị phiến kính
Mỗi mẫu huyết thanh cần dùng 2 phiến kính, mỗi phiến kính chia làm 12 ô, mỗi ô dùng cho một chủng kháng nguyên, những phiến kính này phải thật sạch, không mốc, không bị xước, trước khi dùng phải dùng bông tẩm cồn lau sạch sau đó để khô.
Bước 2 Kiểm tra kháng nguyên
Kiểm tra kháng nguyên bằng mắt thường: soi từng ống nghiệm chứa kháng nguyên lên trước nguồn sáng, nếu thấy kháng nguyên trong, không có kết tủa, khi lắc nhẹ nó vẩn đục như làn khói là những chủng mọc tốt.
Kiểm tra kháng nguyên bằng kính hiển vi: lắc đều từng ống kháng nguyên, pha loãng kháng nguyên với dung dịch đệm, bằng cách cho thêm vào từng ống kháng nguyên 2ml dung dịch đệm, lắc đều. Sau đó nhỏ lần lượt từng chủng kháng nguyên lên phiến kính xem qua kính hiển vi tụ quang nền đen, kháng nguyên đạt yêu cầu phải mọc tốt, phân tán đều trong môi trường (theo hướng dẫn của viện Pasteur Tp.Hồ Chí Minh).
Bước 3 Chuẩn bị huyết thanh
Huyết thanh nếu dự trữ lạnh thì rã đông trong 30 phút, đưa lên máy lắc ống trộn đều, sau đó bắt đầu pha loãng với hiệu giá pha loãng khởi đầu là 1/10 (4,5ml dung dịch đệm với 0,5ml huyết thanh).
Hình 3.3 Sơ đồ pha loãng huyết thanh Figure 6
Bước 4 Tiến hành phản ứng vi ngưng kết
Trên mỗi ô của đĩa nhựa ta dùng pipet hút 0,05ml huyết thanh đã pha loãng ở nồng độ 1/10, nhỏ lần lượt vào mỗi ô 1 giọt, sau đó dùng pipet hút 0,05ml kháng nguyên vào 24 ô huyết thanh, mỗi ô một chủng tương ứng 24 chủng kháng nguyên. Tính chung huyết thanh đã pha loãng ở nồng độ 1/20. Dùng mỗi đầu pipet cho một mẫu huyết thanh và mỗi chủng kháng nguyên. Sau đó lắc nhẹ, cho vào tủ ấm ở nhiệt độ 370C trong 1 giờ hoặc ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ.
0,5ml huyết thanh
Huyết thanh 1/10
Hút một giọt ở mỗi ô nhỏ lên phiến kính. Đọc kết quả dưới kính hiển vi nền đen có độ phóng đại 10 lần. Lần lượt quan sát kết quả ở 24 ô tương ứng với 24 chủng kháng nguyên.
Tiến hành đối chứng âm
Trên mỗi ô của đĩa nhựa nhỏ 0,05ml dung dịch đệm và 0,05ml kháng nguyên sống tương ứng với 1 chủng Leptospira. Dưới kính hiển vi nền đen Leptospira
xuất hiện đều trên vi trường, không tự ngưng kết và chuyển động tốt.
Đánh giá kết quả
Dưới kính hiển vi nền đen với độ phóng đại 10 lần, mức độ ngưng kết được ghi nhận như sau:
- Âm tính (-): xoắn khuẩn không ngưng kết, di động tự do như đối chứng âm. - Dương tính (+): trên vi trường xuất hiện những cụm hay mảng ngưng kết trắng đục, rìa có tua do xoắn khuẩn Leptospira dính vào, số Leptospira tự do ít so với đối chứng âm. Dựa vào mức độ ngưng kết để đánh giá kết quả dương tính.
(http://www.pasteur-kh.org/symposium_2014/files/2014/03/Juan-Carrique_1.pdf)
Hình 3.4 Các mức độ ngưng kết trong phản ứng vi ngưng kết MAT Fiure 7
+ + + +: Tất cả Leptospira ngưng kết, cụm ngưng kết lớn, không có xoắn khuẩn tự do.
+ + +: Trên 75% số xoắn khuẩn bị ngưng kết, ít xoắn khuẩn tự do. + +: Từ 50% số xoắn khuẩn bị ngưng kết, có 1/2 số xoắn khuẩn tự do.
+: Từ 25% đến dưới 50% số xoắn khuẩn bị ngưng kết, nhiều xoắn khuẩn tự do.
Nâng cao hiệu giá
Đối với mẫu huyết thanh xét nghiệm ở mức 2+, 3+, 4+ thì tiếp tục nâng hiệu giá pha loãng huyết thanh lên 1/20, 1/40, 1/80,..cho đến khi phản ứng ngưng kết âm tính hoặc dương tính nhưng mức độ ngưng kết ở dưới mức 2+ thì mẫu huyết thanh hoàn tất.
Cách pha loãng huyết thanh: lấy 1ml huyết thanh ở nồng độ 1/10 pha với 1ml dung dịch đệm, ta có độ pha loãng 1/20. Tương tự, pha loãng huyết thanh đến mức cần thiết.
Hình 3.5 Sơ đồ nâng cao hiệu giá huyết thanh Figure 8
3.4.3 Phương pháp thống kê số liệu
Số mẫu dương tính
Tỷ lệ nhiễm (%) = x 100 Tổng số mẫu khảo sát
Số liệu về mẫu được thu thập và xử lý sơ bộ bằng phần mềm Microsoft Excel 2013. Xử lý thống kê bởi phần mềm Minitab 13 theo phương pháp Chi-square.
1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1ml 1ml dung dịch đệm
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột tại An Giang
Bảng 4.1 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột Table 4
Qua bảng 4.1 cho thấy, trong số 126 mẫu kiểm tra có 41 mẫu dương tính, chiếm tỷ lệ 32,5%. Tỷ lệ này cũng phù hợp với một số kết quả nghiên cứu trước đây.
Theo Quách Quốc Nam (2007) tỷ lệ dương tính chung ở chuột cống và chuột đồng tại Thành Phố Cần Thơ là 32,52%.
Theo nghiên cứu của Nguyễn Văn Nhã (2010) tỷ lệ chuột dương tính xung quanh trại chăn nuôi Công ty cổ phần Thuỷ Sản Sông Hậu (55,56%). Tỷ lệ chuột dương tính của nghiên cứu thấp hơn vì điều kiện địa lý và thời gian lấy mẫu khác nhau, chuột xung quanh trại chủ yếu là chuột cống nó sống gần với heo và bò nên dễ mang mầm bệnh.
4.2 Tỷ lệ nhiễm Leptospira theo giống
Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột theo giống Table 5
Giống chuột Số mẫu xét
nghiệm Số mẫu nhiễm Tỷ lệ (%) P
Chuột cống 54 22 40,7
0,089
Chuột đồng 72 19 26,4
Số mẫu xét nghiệm Số mẫu dương tính Tỷ lệ (%)
Biểu đồ 1. Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột cống và chuột đồngBiểu đồ 1
Qua bảng 4.2 cho thấy, có 22/54 mẫu chuột cống và 19/72 mẫu chuột đồng dương tính với Leptospira, chiếm tỷ lệ lần lượt là 40,7% và 26,4%. Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột cống cao hơn trên chuột đồng, tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (P=0,089).
Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột cống (40,7%) là tương đối cao nhưng lại thấp hơn so với nghiên cứu của Vũ Đình Hưng và ctv (2002) tại Hà Nội, tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột cống là (50,31%). Sự khác nhau đó là do hai địa điểm trên khác nhau về địa lý, môi trường, hơn nữa trong thời gian năm 2002 Hà Nội bùng phát 28 ổ dịch Leptospira trên người (Lê Công Tảo, 2003). Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột đồng là (26,4%) phù hợp với nghiên cứu của Hoàng Mạnh Lâm và ctv (2002) tại DakLak kiểm tra 714 mẫu huyết thanh chuột đồng thì có 151 mẫu dương tính chiếm tỷ lệ (21,1%).
Và kết quả nghiên cứu cũng phù hợp với nghiên cứu của Quách Quốc Nam (2007) tại Cần Thơ, tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột cống là 46% và chuột đồng là 23,28%.
Chuột cống có tỷ lệ nhiễm cao hơn chuột đồng là do chuột cống thường ăn tạp và sống gần các trang trại, khu công nghiệp, khu đông dân cư, ở các chợ, bệnh viện, bãi rác, ống cống…là những nơi có nhiều mầm bệnh cư trú.
4.3 Tỷ lệ nhiễm Leptospira theo địa điểm
Bảng 4.3 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột theo địa điểmble 6
Địa điểm Số mẫu xét
nghiệm Số mẫu nhiễm
Tỷ lệ % P Long Xuyên 40 11 27,5 Tân Châu 42 13 30,9 0,534 Tịnh Biên 44 17 38,6 Tổng cộng 126 41 100
27,5 30,9 38,6 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Long Xuyên Tân Châu Tịnh Biên
Tỷ lệ (%)
Biều đồ 2. Tỷ lệ nhiễm Leptospira theo địa điểm Biểu đồ 2
Từ bảng 4.3 cho thấy, chuột ở Long Xuyên dương tính với Leptospira là 27,5%, ở Tân Châu 30,9% và ở Tịnh Biên nhiễm 38,6%. Tuy nhiên tỷ lệ nhiễm Leptospira giữa các địa điểm trên khác nhau không có ý nghĩa thống kê (p=0,534).
Chuột ở Tịnh Biên nhiễm Leptospira với tỷ lệ cao hơn các địa điểm nghiên cứu khác là do Tịnh Biên là huyện có ngành chăn nuôi trâu bò truyền thống, là huyện tiếp giáp biên giới Campuchia, thường ngày súc vật được trao đổi buôn bán qua các cửa ngạch với số lượng lớn, hệ thống kiểm dịch không đảm bảo. Hằng năm thường xảy ra ngập lụt kéo dài tạo điều kiện cho sự sinh trưởng và phát triển của Leptospira. Chuột ở Long Xuyên nhiễm với tỷ lệ thấp hơn là do đây là trung tâm thành phố của An Giang, có điều kiện kinh tế xã hội phát triển, nguồn nước công nghiệp và sinh hoạt được xử lý tốt nên ít tạo cơ hội cho mầm bệnh phát triển.
Kết quả trên phù hợp nghiên cứu của Lê Huỳnh Thanh Phương (2001). Tỷ lệ nhiễm Leptospira ở vùng đồng trũng chiếm tỷ lệ cao nhất (28,94%), thành phố và vùng phụ cận chiếm tỷ lệ thấp nhất (18,89%).
4.4 Tỷ lệ nhiễm các chủng Leptospira trên chuột
Bảng 4.4 Tỷ lệ nhiễm các chủng Leptospira trên chuột Table 7
Stt Chủng Leptospira Chuột cống Chuột đồng Số lượt Tỷ lệ % Tỷ lệ (%) 1 L. australis Ballico 2 2 2,41 2 L. autumnalis Akiyami A 1 1 2 2,41
3 L. bataviae Van Tienen 2 2 2,41
4 L. canicola Hond Utrecht IV 2 1 3 3,61
5 L. castellonis Castellon 3 0 0 0,00 6 L. copenhageni Wijnberg 7 2 9 10,84 7 L. pyrogenes Salinem 1 1 1,20 8 L. tonkini LT 9668 4 4 4,82 9 L. icterohaemorrhagiae Verdun 7 4 11 13,25 10 L. cynopterie 3522 C 1 4 5 6,02 11 L. gryppotyphosa Moskva V 2 5 7 8,43
12 L. hardjo Hardjo Bovis 4 4 4,82
13 L. hebdomadis Hebdomadis 3 3 3,61 14 L. javanica Veldrat Bataviae 46 5 5 6,02 15 L. panama CZ 214K 4 1 5 6,02 16 L. patoc Patoc 1 1 1 1,20 17 L. pomona Pomona 3 2 5 6,02
18 L. tarassovi Mitis Johnson 0 0 0,00
19 L. vughia LT 09 68 1 1 1,20 20 L. hardjo Hardjoprajitno 1 1 1,20 21 L. saxkoebing Mus 24 0 0 0,00 22 L. canicola Chiffon 7 1 8 9,64 23 L. louisiana LSU 1945 1 2 3 3,61 24 L. husbridge Husbridge 1 1 1,20 Tổng cộng 60 23 83 100
Qua bảng 4.4 cho thấy, thành phần các chủng Leptospira nhiễm trên chuột rất đa dạng và phức tạp, trong 24 chủng Leptospira dùng chẩn đoán huyết thanh học thì có 21 chủng dương tính với chuột.
- Các chủng Leptospira chính ở chuột cống là: L. icterohaemorrhagiae copenhagini Wijnberg, L. canicola canicola Chiffon, L. icterohaemorrhagiae Verdun, L. javanica javanica Veldrat Bataviae 46.
- Các chủng Leptospira chính ở chuột đồng là: L. gryppotyphosa gryppotyphosa Moskva V, L. icterohaemorrhagiae Verdun, L. cynopterie cynopterie 3522C, L. pomona pomona Pomona.
- Tính chung cả chuột cống và chuột đồng thì:
L. icterohaemorrhagiae Verdun 13,25%
L. icterohaemorrhagiae copenhagini Wijnberg 10,84%
L. canicola canicola Chiffon 9,64%
L. gryppotyphosa gryppotyphosa Moskva V 8,43%
L. pomona pomona Pomona 6,02% Kết quả này cũng phù hợp với các kết quả nghiên cứu trước đây Theo Vũ Đình Hưng và ctv (2002) tỷ lệ nhiễm của chuột tại Hà Nội là:
L. canicola 9,42%
L. Pomona 8,9%
L. icterohaemorrhagiae 8,9%
Theo Quách Quốc Nam (2007) tỷ lệ nhiễm của chuột tại Cần Thơ là:
L. canicola 17,14%
L. autumnalis 14,29%
L. icterohaemorrhagiae 12,86%
Từ kết quả trên nhận thấy chuột ở An Giang và Cần Thơ thường bị nhiễm chung các chủng phổ biến gây bệnh cho người và gia súc như L. icterohaemorrhagiae Verdun, L. canicola canicola Chiffon, L. pomona pomona Pomona…nguyên nhân trên là do thói quen của đa số người dân hay vứt bỏ bừa bãi phân người, phân gia súc – gia cầm, xác súc vật mang mầm bệnh xuống sông…làm cho mầm bệnh phát triển trong môi trường nước cùng với đó là trong bối cảnh hiện nay nhu cầu tiêu thụ thịt chuột trong cộng đồng rất lớn và đây chính là những điều kiện để các chủng Leptospira và nhiều dịch bệnh khác phát tán đều ở các tỉnh lân cận.
4.5 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột theo hiệu giá ngưng kết
Bảng 4.5 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột theo hiệu giá ngưng kết Table 8
Hiệu Giá Số mẫu nhiễm Tỷ lệ (%)
1/20 22 53,66 1/40 9 21,95 1/80 6 14,63 1/160 3 7,32 1/320 1 2,44 Tổng cộng 41 100
Biểu đồ 3. Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột theo hiệu giá ngưng kết ểu đồ 3
Đối với chuột ở mức hiệu giá ngưng kết ≥1/20 được xác định là dương tính với Leptospira (Theo hướng dẫn của viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh).
Qua kết quả trình bày ở bảng 4.5 nhận thấy, ở mức hiệu giá 1/20 có 22 mẫu dương tính chiếm tỷ lệ cao nhất (53,66%), ở mức hiệu giá 1/320 có 1 mẫu dương tính chiếm tỷ lệ thấp nhất (2,44%), hiệu giá kháng thể ngưng kết tập trung chủ yếu ở mức từ 1/20 đến 1/80.
Theo kết quả nghiên cứu của Sharon (2009) điều tra tình hình nhiễm
Leptospira trên chuột tại Philippine, hiệu giá ngưng kế 1/20 chiếm tỷ lệ cao nhất 19,39% (19/98), hiệu giá 1/5120 chiếm tỷ lệ thấp nhất 1,02% (1/98), hiệu giá kháng thể ngưng kết tập trung chủ yếu ở mức 1/20 đến 1/320. Sở dĩ hiệu giá ngưng kết của chúng tôi thấp hơn là do trong năm 2009 tại Philippine xảy
ra dịch Leptospirosis nên đó là một trong những nguyên nhân chính làm cho chuột có hàm lượng kháng thể cao (Alshere, 2009).
Hiệu giá kháng thể phản ánh hàm lượng kháng thể có trong máu chuột. Hiệu giá càng cao chứng tỏ mức độ nhiễm xoắn khuẩn càng cao.
4.6 Tỷ lệ nhiễm ghép các chủng Leptospira trên chuột
Bảng 4.6 Tỷ lệ nhiễm ghép các chủng Leptospira trên chuột Table 9
Số chủng nhiễm ghép Tên các chủng nhiễm ghép Số mẫu nhiễm Tỷ lệ (%)
2 L. bataviae, L. hebdomadis, L. Pomona, L. icterohaemorrhagiae, L. australis, L. panama, L. Pomona, L. canicola
15 36,59
3 L. cynopterie, L. hebdomadis, L. javanica, L. bataviae
7 17,07
4 L. canicola, L. icterohaemorrhagiae, L. hebdomadis, L. panama, L. canicola
4 9,75
5 6
L. bataviae, L. copenhageni, L.