Là phương pháp cơ bản và quan trọng nhất trong chẩn đoán Leptospirosis vì nó không chỉ xác định được vi khuẩn gây bệnh mà còn cho biết chủng
Leptospira nào gây bệnh (Palmer, 1988).Phương pháp này đòi hỏi phải có các chủng Leptospira đã biết, số lượng chủng tuỳ thuộc từng nơi, từng nước sử dụng và huyết thanh chẩn đoán lấy ở thú nghi bệnh.
Thú sau khi nhiễm bệnh khoảng một tuần trong máu có kháng thể, sau 3 tuần hàm lượng kháng thể trong máu cao nhất rồi giảm dần (Hanson et al., 1986). Các phương pháp chẩn đoán huyết thanh học để phân biệt các chủng
Phản ứng vi ngưng kết - MAT
Phản ứng MAT đặc biệt có ý nghĩa trong những trường hợp mắc bệnh thể cấp tính (người ta đã chứng minh hiệu giá kháng thể tăng 4 lần khi gia súc đang mắc bệnh so với thời kỳ hồi phục). Trường hợp mắc bệnh thể mãn tính, hoặc chẩn đoán sẩy thai ở gia súc thì phản ứng còn có một số nhược điểm, độ nhạy thấp (Phạm Sỹ Lăng và Hoàng Văn Năm, 2012).
Phản ứng dựa trên nguyên tắc kháng thể đặc hiệu xuất hiện trong huyết thanh thú bị nhiễm Leptospira sẽ ngưng kết với kháng nguyên Leptospira. Sự ngưng kết sẽ được đọc trên kính hiển vi nền đen.. Sự giảm một cách đáng kể mật độ
Leptospira tự do là do Leptospira kết tụ lại với nhau rất chặt chẽ tạo nên những “hạt bi” rất nhỏ, hình tròn có lông tủa ra xung quanh hoặc từng đám hình mạng nhện nằm trong vi trường mà ta không nhìn thấy được bằng mắt thường, khi quan sát dưới kinh hiển vi nền đen thấy trên vi trường hiện ra như bầu trời tối có những vì sao sáng.
Mỗi nhóm huyết thanh Leptospira có kháng thể đặc hiệu riêng nên khi chẩn đoán xoắn khuẩn bằng phương pháp MAT người ta chỉ sử dụng những chủng huyết thanh đại diện cho nhóm huyết thanh.
Bộ kháng nguyên dùng trong phản ứng vi ngung kết (MAT) có thể là kháng nguyên sống hoặc đã bị giết chết. Lợi điểm của Leptospira sống là nhạy hơn, ít có phản ứng chéo hơn. Nhưng bất tiện là dễ bị tạp nhiễm và phải thường xuyên duy trì bộ kháng nguyên sống. Đây là một việc làm hết sức phức tạp, công phu và chỉ có thể thực hiện được ở những phòng thí nghiệm chuẩn về
Leptospira. Trái lại, dùng kháng nguyên chết sẽ thuận lợi ở chỗ dễ bảo quản (có thể dùng 1 đến 2 tháng), không tạp nhiễm. Tuy nhiên, phản ứng này lại có độ nhạy kém hơn so với kháng nguyên sống, có nhiều phản ứng chéo và hiệu giá pha loãng có thể bị giảm đi. Nếu mật độ kháng nguyên giảm thì sự ngưng kết huyết thanh đôi khi tăng lên một cách đáng kể. Những chủng huyết thanh địa phương và chủng huyết thanh mới phân lập cho phản ứng tốt hơn chủng huyết thanh tiêu chuẩn khác, do đó tuỳ theo mỗi vùng mà sử dụng kháng nguyên thích hợp để chẩn đoán (Phạm Sỹ Lăng và Hoàng Văn Năm, 2012).
Phản ứng ELISA
Phản ứng được sử dụng để phát hiện kháng thể với các kháng nguyên chuẩn đã có. Thông thường, phản ứng có độ nhạy cao, nhưng độ dặc hiệu với các chủng thấp hơn so với MAT. Đặc biệt, sử dụng phản ứng ELISA xác định được IgG và IgM có trong huyết thanh chó kháng nhiều chủng khác nhau. IgM kháng Leptospira có thể phát hiện sớm trong vòng 1 tuần sau khi nhiễm, khi mà kháng thể ngưng kết chưa hình thành; trong khi đó IgG được phát hiện
sau khi chó bị nhiễm 2 tuần và kéo dài trong một thời gian dài (Phạm Sỹ Lăng, Hoàng Văn Năm, 2012).
Phản ứng ELISA được ứng dụng trong chẩn đoán Leptospira dương tính nhờ vào việc xác định kháng thể IgM và IgG. Tuy nhiên, ELISA lại âm tính trong khoảng 2 tháng sau khi nhiễm bệnh và không giúp phát hiện được những kháng thể còn sót lại của sự miễn dịch trước đó. Người ta đã chứng minh có sự xuất hiện ngay từ đầu kháng thể IgM có tính không đặc hiệu, gây ngưng kết rộng cho nhiều chủng huyết thanh, do đó có thể làm sai lệch kết quả trong việc định chủng huyết thanh nếu lấy máu ngay từ khi bệnh mới bắt đầu. Cũng chính lý do này, ELISA dùng để xác định kháng thể IgM giúp phân biệt được bệnh đã xảy ra hay bệnh mới bắt đầu, còn IgG xuất hiện từ ngày thứ sáu hoặc muộn hơn nhưng lại có tính đặc hiệu cao đối với từng chủng huyết thanh gây bệnh (Ellis, 1999).
Phản ứng miễn dịch huỳnh quang (IF - Immuno fluorescence)
Khi kháng nguyên kết hợp với kháng thể được nhuộm bằng thuốc nhuộm huỳnh quang (thường dùng fluorescein isothiocyanat màu xanh lục, rodamin có màu đỏ gạch) thì phức hợp kháng nguyên - kháng thể sẽ phát sáng dưới kính hiển vi huỳnh quang (Lê Văn Hùng, 2002). Phản ứng này có độ nhạy khá cao nhưng độ đặc hiệu thì trung bình, chỉ được dùng ở một vài phòng thí nghiệm.
Phản ứng kết hợp bổ thể (CF- Complement fixation)
Phản ứng này cho kết quả tốt trong chẩn đoán Leptospirosis cho hàng loạt gia súc nhưng không biết được gia súc mắc phải chủng huyết thanh nào, muốn biết phải làm phản ứng MAT. Phản ứng này ít dược sử dụng vì tính không ổn định, tính khó bảo quản của thuốc thử và khả năng chống bổ thể của huyết thanh.