3. VẬT LIỆU, NÔI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.2Phương pháp nghiên cứu
3.3.2.1 Quan sát số lượng nhiễm sắc thể (theo Seshadri 1986)
Các bước tiến hành.
- Hạt ựược gieo trong các cốc giấy và ựể trong tủ ựịnh ôn với nhiệt ựộ là 250C và thời gian chiếu sáng 9h. Sau 5 ngày thu rễ ựể tiến hành thắ nghiệm, xủ lý rễ bằng colchicines 0.1 Ờ 0.05% trong 3h ựể cố ựịnh nhiễm sắc thể, bảo quản mẫu bằng dung dịch CarnoyỖs Solution 1 ( 1 acid acetic / 3 ethanol 95% trong tủ lạnh 40C);
* thành phần thuốc nhuộn: 1 g fushsin gốc, 200ml dd H20 , 30ml 1N HCL, 3g K2S2O5, 0.5g than hoạt tắnh
* Nhuộm màu: Rửa rễ trong nước cất ựể loại bỏ hết dung dịch cố ựịnh,thủy phân rễ trong dd HCL 1N ở 600C trong 6 phút,nhuộm màu bằng Feugen, quan sát dưới kắnh hiển vi: cho dầu rễ lên lam kắnh, nhỏ một giọt Acetocamine, ựậy lam kắnh, quan sát dưới kắnh hiển vi mức ựộ phóng ựại 100 lần, quan sát và xác ựịnh số lượng nhiễm sắc thể trong tế bào, các tế bào quan sát ựược lưu lại bằng hệ thống máy ảnh gắn trên kắnh hiển vi.
3.3.2.2. Phân tắch mức ựộ ựa bội bằng phương pháp flow cytometry theo Dolezel, 1997
Các bước tiến hành.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 27 1. dung dịch A dung dịch nhuộm nhân ( 25 mL cho 15 mẫu ): 24mL MgSO4 ựệm ựể ựóng băng, 25mg dithiotheriol, 500ộL propidium iodide (PI) stock, 625 ộL triton X Ờ 100 stock
2. dung dịch B dung dich ựệm (7.5 mL cho 15 mẫu): 7.5 mL dung dịch A, 17.5 ộL Rnase
- Chuẩn bị dung dịch huyền phù từ mô thực vật
Cân 20 mg lá của mẫu cần xác ựịnh và ựối chứng cho vào ựĩa petri giữ lạnh, cắt nhỏ thành các mảnh 0,5 mm, thêm 1mL dung dịch A, lọc qua giấy nylon với ựường kắnh giấy lọc 0,35ộm vào ống ựiện di, thu lấy phần dung dịch lọc ựược, lọc phần nổi trên ống ựiện di, cho vào pepet, thêm 200 Ờ 400 ộL dung dịch B, lắc nhẹ nhàng khoảng 1 phút, ựể ổn ựịnh khoảng 5 phút, ựưa dung dịch vào vị trắ phân tắch của máy, chạy mẫu trên máy Flow Cytometry (Power PA), lấy kết quả thu ựược và vẽ biểu ựồ biểu diễn mỗi quan hệ ựể xác ựịnh mức ựộ ựa bội.
3.3.2.3. Xác ựịnh kiểu nhân theo phương pháp Levan et al. (1964)
Ảnh nhiễm sắc thể ở kỳ giửa ựược chụp, phóng ựại ở mức ựộng phóng ựại 100X, sau khi ảnh ựược chụp, dùng phương pháp thủ công cắt rời từng chiếc, dựa vào hệ thống quy ước về kắch thước, vị trắ tâm ựộng ựể sắp xếp các cặp nhiễm sắc thể theo thứ tự từ lớn ựến bé. Vai dài quay xuống và vai ngắn quay lên (1 lớn nhất Ờ 7 bé nhất)
3.3.2.4.. Phân tắch ựa dạng di truyền bằng phương pháp isozyme (Shigyo, 1997)
a)Tạo gell
Bảng 3.2. Các hóa chất chắnh trong quá tình tạo gell Ký hiệu Thành phần dung dịch trong 100 ml pH Ghi chú
A 1N HCl 48.0 ml,Tris 36.3 g, TEMED 0.23 ml 8.9 B 1N HCl 48.0 ml, Tris 5.98 g, TEMED 0.46 ml 6.7 C Acrylamide 28.0 g, Bis-acrylamide 2.5 g D Acrylamide 10.0 g, Bis-acrylamide 2.5 g E Riboflavin 4.0 mg G Ammonium peroxodisuflate 0.14 g 0.07g/50 ml
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 28
+ Tạo gell phân ly
Cho lần lượt hóa chất vào bình tam giác: A (3ml); C(4ml); nước cất (3ml); G (12ml) trộn ựều lắc kỹ. Thể tắch dung dịch C phụ thuộc vào từng isozyme: GOT, SKDH: sử dụng 5%- C: 4ml; LAP, PGI: sử dụng gel 7% - C: 6 ml). đổ hỗn hợp dung dịch vào khuôn gel ựến vạch cho phép. đợi 1h 30 phút, acrylamide tạo thành.
+ Tạo gell cô ựặc.
Cho toàn bộ các dụng dịch chất hòa tan vào bình tam giác: B (1ml), D (2ml), nước cất (4ml), E (1ml). Trộn ựều lắc kỹ, ựổ hỗn hợp dung dịch vào khuôn gel, lắp lược vào khuôn gel, ựợi 1 h, cacrylamide tạo thành.
+ Tách chiết enzyme
Thành phần dung dịch ựêm chiết tách theo Wendell (1983). Mỗi mẫu thắ nghiêm (0.1 gr) sử dụng 500 ộl buffer.
Bảng 3.3. Thành phần của dung dịch ựệm trong chết tách emzyme
+ Chiết tách enzyme
- Chiết tách enzyme từ lá non, nghiền nhỏ bằng cối sứ ở phòng lạnh 40C sau ựể khoảng 1h, lọc các cặn không tan bằng giấy siêu lọc, diện di trên máy ựiện di, ựiều kiện ựiện tùy theo từng loại isozyme;
- Dung dich chiết tách gồn có: Cứ 0,01g mô lá cần có 0,1ml dung dịch ựệm (0,67g/lTrisbase và 7,02g/lTris-HC), pH 7,1. Thành phần dung dịch ựệm chiết tách 250ml 50ml Na2HPO4, Sucrose, PVP-40 (k-30) 1.5g 17.5g 12.52g 0.3g 3.5g 2.5g EDTA, Dithiothreitol (DTT), L-ascorbin Na, acid-sodiunsalt 125mg 125mg 250mg 250mg 25mg 25mg 50mg 50mg Na-Bisulfite (sodium-Pyrosulfite ) 125mg 25mg Lên thể tắch bằng nước cất 250ml 50ml
Mecarptoethanol pha trộn với tỷ lệ 1/1000 ngay trước khi
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 29
Bảng 3.4.Tên ựầy ựủ, ký hiệu viết tắt và dung dịch ựệm ựược sử dụng trong ựiện di (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.3.2.5. Phân tắch hàm lượng Acid ascorbic và ựộ Brix của quả
a) Phân tắch hàm lượng acid ascorbic theo (Roe et al., 1948)
- Cân 200 gam thịt quả tươi, nghiên trong cối sứ với dung dịch dung dịch metaphotphoric acid 10% (dung dịch chiết tách ascorbic acid) cho ựến khi tạo thành dịch sánh, lọc qua hệ thống lọc và thu ựược dung dịch và cho vào các ống nghiệm 1 mL, cho 1 mL dung dịch metaphotphoric acid 2%, cho 1 mL dung dịch DNP (2,4-dinitrophenylhydrazine) vào các ống nghiệm chiết tách ascorbic acid, ủ ở nhiệt ựộ 500 C trong 70 phút. Cho 2,5 mL ding dịch sulfuric acid 85%, ựể 30 phút và tiến hành ựo hàm lượng ascorbic acid ựược xác ựịnh bằng máy do quang phổ ở bước sóng 520nm.
- Công thức xác ựịnh hàm lượng acid ascobic
- Ascobic acid (mg/ 100 grams fresh weight) = Xx50x100/2.5x1/1000, X ựược tắnh từ công thức: Y=0.0113X + 0.0126; Y là ABS (kết quả ựo ựược từ bước sóng 520 nm)
b) Xác ựịnh ựộ brix của dịch quả và màu sắc vỏ quả
- đối với việc xác ựịnh ựộ brix của dịch quả, chúng tôi sử dụng dụng cụ xác ựịnh ựộ brix cầm tay.
- Màu sắc vỏ quả ựược xác ựịnh bằng máy xác ựịnh nhanh hàm lượng diệp lục trong vỏ quả. 9 ựiểm tương ứng với 3 vị trị trên quả ựược xác ựịnh hàm
Enzyme Tên viết tắt EC Number
Glutamate-Oxaloacetate Transaminase GOT 2.6.1.1
Leucine Aminopeptidase LAP 3.4.11.1
Phospho Glucoisomerase PGI 5.3.1.9
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 30 lượng diệp lục.
c) đánh giá cảm quan hàm lượng Vitamin A dựa vào màu sắc ruột quả theo Royal Horticultural Society (RHS) (2005) bằng cách sử dụng các thang màu ựể so sánh, các thang màu biến ựộng từ màu cam, vàng, xanh và trắng.
d) Khảo sát một số tắnh trạng hình thái quả.
Tắnh trạng hình thái quả ựược xem xét ở các chỉ tiêu sau: Khối lượng quả, đường kắnh (ựo ở 3 vị trắ trên quả và lấy số liệu trung bình), Chiều dài quả,
- Mật ựộ gai quả và màu sắc gai quả, Mày sắc vỏ quả xác ựịnh theo UPOV theo các thang ựiểm từ 3 ựến 9
- Xác ựịnh vị quả ựiển hình bằng phương pháp cảm quan
- Phân nhóm da dạng di truyền dựa các ựặc ựiểm hình thái quả
f) Số liệu nghiên cứu ựược xử lý thống kê trên Excel với các thông số về trung bình, ựộ lệch chuẩn và sai số chuẩn.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 31