3. Nội dung nghiên cứu
3.5.1.Phản ứng gắn gen cần nghiên cứu vào vector pBT
Vector pBT rất thuận lợi cho thao tác ghép nối các đoạn DNA ngoại lai do chúng đƣợc thiết kế dƣới dạng mở vòng mạch thẳng với hai đầu 3' của mỗi sợi gắn thêm nucleotide T. Sở dĩ sản phẩm của phản ứng PCR, có thể gắn vào vector pBT là do ở giai đoạn cuối của phản ứng PCR, enzyme Taq polymerase có gắn thêm một nucleotide là Adenine (A) vào đầu 3' của đoạn gen đƣợc khuếch đại nên khi nối vào vector pBT có đầu nối là Thymine (T), hai nuleotide này sẽ bắt cặp bổ sung với nhau, dƣới sự xúc tác của enzyme nối ligase sẽ nối nhóm - OH của nucleotide này
500bp 250bp
700bp
với nhóm PO4-3 của nucleotide kế bên hình thành liên kết photphoeste nối hai nuleotide với nhau nên DNA ngoại lai này đƣợc gắn vector tách dòng tạo nên plasmid tái tổ hợp. Vì vậy, phƣơng pháp này còn gọi là phƣơng pháp dòng hóa T-A. Thành phần phản ứng tạo vector tái tổ hợp đã đƣợc trình bày ở mục 2.3.4.
3.5.2. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α
Chúng tôi sử dụng phƣơng pháp sốc nhiệt để chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α. Khi nhiệt độ tăng đột ngột màng tế bào khả biến có tính co dãn làm xuất hiện các lỗ trống, vector tái tổ hợp sẽ đi vào trong tế bào thông qua những lỗ trống này. Vì vector tách dòng pBT có chứa gen chỉ thị lacZ mã hóa cho enzyme β - galactosidase nên khi bổ sung chất chỉ thị là X-gal (5-bromo-4chloro- 3indolyl-beta-D-galactose pyranoside) enzyme β - galactosidase sẽ phân hủy chất chỉ thị theo phản ứng sau:
X-gal galactose + 4Cl-3-Br-indigo (có màu xanh)
Sau khi nuôi cấy qua đêm (16-18 giờ) ở nhiệt độ 370C sẽ xuất hiện hai loại khuẩn lạc trắng và xanh (Hình 3.4). Khuẩn lạc màu trắng là tế bào đã biến nạp thành công và có khả năng mang plasmid chứa đoạn DNA quan tâm (vì đoạn DNA này đã đƣợc chèn vào vị trí của gen mã hóa cho enzyme β - galactosidase). Khuẩn lạc màu xanh là tế bào đã biến nạp thành công nhƣng trong plasmid không chứa đoạn DNA quan tâm nên gen β - galactosidase vẫn hoạt động tạo ra enzyme phân hủy X - gal thành 4Cl-3-Br-indigo làm cho khuẩn lạc có màu xanh. Nhƣng những khuẩn lạc màu trắng chƣa chắc chắn là chứa plasmid tái tổ hợp với đoạn DNA quan tâm, trong trƣờng hợp này có thể do plasmid gắn với một đoạn gen DNA lạ khác nhiễm vào hoặc plasmid không đƣợc biến nạp vào trong tế bào. Để có kết quả chính xác phải tiếp tục sàng lọc khuẩn lạc.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.4. Kết quả biến nạp khuẩn lạc