3. Nội dung nghiên cứu
3.2. Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số
Nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số đƣợc kiểm tra theo phƣơng pháp quang phổ kế (phƣơng pháp đo OD).
Phƣơng pháp này dựa vào sự hấp thụ cực đại tia tử ngoại ở bƣớc sóng 260nm (A260nm) đối với acid nucleic và bƣớc sóng 280nm (A280nm) đối với protein. Để xác định nồng độ DNA ta dựa vào chỉ số A260, một đơn vị A260nm ứng với nồng độ của acid nucleic sợi kép đạt 50µg/ml. Dựa vào tỉ lệ giữa A260nm / A280nm ta có thể xác định đƣợc độ tinh sạch của sản phẩm tách DNA. Một sản phẩm tách DNA đƣợc coi là tinh sạch khi tỉ lệ A260nm / A280nm nằm trong khoảng 1,8 - 2,0 [5].
Nồng độ DNA (µg/ml) đƣợc tính theo công thức: CDNA = A260nm x 50 x d (d: là độ pha loãng mẫu)
Kết quả kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA tổng số từ các mẫu bệnh phẩm đƣợc trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1: Kết quả đo OD của các mẫu nghiên cứu SSTT Mã DNA Mã chủng Nồng độ DNA (ng/ul) OD260/280 1 ĐA1-05 TB05-1 46,3 1,55 2 ĐA3-05 TB05-97 3,6 1,37 3 ĐA4-05 TB05-108 49,2 1,69 4 ĐA5-05 TB05-117 24,3 1,60 5 ĐA6-05 TB05-138 28,93 1,41 6 ĐA7-05 TB05-146 110,4 1,59 7 ĐA10-05 TB05-199 7,75 2,11 8 ĐA11-05 TB05-213 18,7 1,59 9 ĐA13-05 TB05-221 73,3 2,00 10 ĐA15-05 TB05-254 28,2 1,68 11 ĐO1-05 TB05-49 15,19 1,64 12 ĐO2-05 TB05-79 16,9 1,84 13 ĐO8-05 TB05-214 20,1 1,91 14 ĐO9-05 TB05-223 38,4 1,79 15 ĐO10-05 TB05-231 84,2 1,69 16 ĐO11-05 TB05-237 129,7 1,52 17 ĐO12-05 TB05-243 53,2 1,75
Kết quả trong bảng 3.1 cho thấy một số mẫu DNA có tỷ lệ OD 260/280 nằm trong khoảng 1,8 - 2,2. Bên cạnh đó, có một số mẫu DNA độ tinh sạch chƣa thật tốt. Điều này là do mẫu từ bệnh phẩm của ngƣời bệnh có những đặc thù khác nhau nên độ tinh sạch không đồng đều. Tuy nhiên, với nồng độ cũng nhƣ độ tinh sạch của các mẫu DNA này vẫn đủ điều kiện để nhân dòng đoạn gen katG và gen inhA bằng kỹ thuật PCR.
3.3. Kết quả nhân dòng đoạn gen inhA và gen katG
Sử dụng sản phẩm DNA tổng số từ các mẫu bệnh phẩm đã đƣợc tách chiết làm khuôn mẫu, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn gen có chứa vùng đột biến của vi khuẩn lao.
Thành phần phản ứng PCR và chu kì nhiệt đã đƣợc trình bày ở mục 2.3.2. Kết quả của phản ứng PCR đƣợc kiểm tra trên gel agarose 1%.
3.3.1. Kết quả nhân dòng đoạn gen inhA
Sử dụng cặp mồi inhA-R và inhA-F, chúng tôi đã tiến hành nhân đoạn gen
inhA từ 17 mẫu bệnh phẩm DNA của vi khuẩn lao bằng kỹ thuật PCR. Kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.1.
Hình 3.1. Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen inhA
M: Marker 1kb, ĐA1-ĐA3-ĐA4-ĐA5-ĐA6-ĐA7-ĐA10-ĐA11-ĐA13-ĐA15-ĐO1-ĐO2- ĐO8-ĐO9-ĐO10-ĐO11-ĐO12 Chủng kháng thuốc, ĐC: Đối chứng âm
+ Kết quả từ hình 3.1 cho thấy cả 17 chủng vi khuẩn lao đều xuất hiện băng DNA có chiều dài khoảng 501bp. Các vạch DNA đặc hiệu rõ dàng, không có vạch phụ kèm theo và có kích thƣớc phù hợp với tính toán lý thuyết. Điều này chứng tỏ đoạn gen
inhA đã đƣợc nhân đặc hiệu.
3.3.2. Kết quả nhân dòng đoạn gen katG
Tƣơng tự với gen inhA, với cặp mồi katG-R và katG-F, chúng tôi đã nhân đƣợc đoạn DNA đặc hiệu có kích thƣớc khoảng 684bp của gen katG, đúng với tính
500bp 250bp 501bp 501bp 500bp 250bp 700 bp 700 bp
toán lý thuyết khi thiết kế mồi. Điều này cũng chứng tỏ đoạn gen katG đã đƣợc nhân đặc hiệu (Hình 3.2).
Hình 3.2. Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen katG M: Thang chuẩn DNA 1kb, ĐA1-ĐA3-ĐA4-ĐA5-ĐA6-ĐA7
Chủng kháng đa thuốc,(-): Đối chứng âm
+ Đối chứng âm là mẫu có chứa đầy đủ các thành phần của phản ứng PCR, chỉ khác là thay mẫu DNA bằng nƣớc cất. Kết quả sau khi điện di không cho một băng nào. Điều này chứng tỏ trong quá trình thao tác không bị nhiễm DNA lạ. Mục đích chính của mẫu đối chứng âm là xem băng DNA thu đƣợc có phải là đoạn DNA quan tâm hay là DNA của vật lạ nhiễm vào do quá trình thao tác hoặc do dụng cụ thí nghiệm, hóa chất bị nhiễm bẩn.
Nhiều nghiên cứu đã thực hiện khi nhân đoạn gen katG và gen inhA đều cho kết quả dƣơng tính. Nhƣ vậy kết quả của chúng tôi cũng tƣơng tự với những công bố khác trong và ngoài nƣớc.
3.4. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR
Sau khi thực hiện phản ứng PCR chúng tôi tiếp tục tinh sạch sản phẩm PCR theo quy trình của bộ kit "AccuPrep®
Gel Purification Kit (Bioneer)". Đây là phƣơng pháp thu đoạn DNA tinh khiết dựa trên nguyên lý sử dụng các hạt sepharose để giữ các phân tử DNA đã đƣợc gắn với các hạt ion trong đệm lúc làm tan gel. Do đó khi chuyển hỗn hợp DNA, agarose, muối... lên cột phân tách, chỉ có
700bp 500bp
DNA đƣợc gắn lên mạng lƣới còn các thành phần khác nhƣ protein, muối sẽ bị rửa trôi qua cột. Sau đó để tách DNA ra khỏi cột ngƣời ta sử dụng dung dịch đệm hòa tan DNA hoặc nƣớc cất khử ion. Tiến hành kiểm tra kết quả bằng cách điện di trên agarose 1%. Kết quả đƣợc trình bày trong hình 3.3.
(A) (B)
Hình 3.3. Điện di sản phẩm tinh sạch DNA
(A) Sản phẩm tinh sạch đối với đoạn gen inhA. (B) Sản phẩm tinh sạch đối với đoạn gen katG. M: Thang chuẩn DNA 1kb, ĐA-ĐA1-ĐA3-ĐA4-ĐA5-ĐA6-ĐA7-ĐA10
Chủng kháng đa thuốc
Kết quả trên hình 3.3 cho thấy, chỉ xuất hiện một băng duy nhất có kích thƣớc khoảng 684 bp (B) ứng với cặp mồi katG và 501bp (A) ứng với cặp mồi
inhA, điều đó chứng tỏ quy trình tinh sạch DNA đã thành công.
3.5. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α
3.5.1. Phản ứng gắn gen cần nghiên cứu vào vector pBT
Vector pBT rất thuận lợi cho thao tác ghép nối các đoạn DNA ngoại lai do chúng đƣợc thiết kế dƣới dạng mở vòng mạch thẳng với hai đầu 3' của mỗi sợi gắn thêm nucleotide T. Sở dĩ sản phẩm của phản ứng PCR, có thể gắn vào vector pBT là do ở giai đoạn cuối của phản ứng PCR, enzyme Taq polymerase có gắn thêm một nucleotide là Adenine (A) vào đầu 3' của đoạn gen đƣợc khuếch đại nên khi nối vào vector pBT có đầu nối là Thymine (T), hai nuleotide này sẽ bắt cặp bổ sung với nhau, dƣới sự xúc tác của enzyme nối ligase sẽ nối nhóm - OH của nucleotide này
500bp 250bp
700bp
với nhóm PO4-3 của nucleotide kế bên hình thành liên kết photphoeste nối hai nuleotide với nhau nên DNA ngoại lai này đƣợc gắn vector tách dòng tạo nên plasmid tái tổ hợp. Vì vậy, phƣơng pháp này còn gọi là phƣơng pháp dòng hóa T-A. Thành phần phản ứng tạo vector tái tổ hợp đã đƣợc trình bày ở mục 2.3.4.
3.5.2. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α
Chúng tôi sử dụng phƣơng pháp sốc nhiệt để chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α. Khi nhiệt độ tăng đột ngột màng tế bào khả biến có tính co dãn làm xuất hiện các lỗ trống, vector tái tổ hợp sẽ đi vào trong tế bào thông qua những lỗ trống này. Vì vector tách dòng pBT có chứa gen chỉ thị lacZ mã hóa cho enzyme β - galactosidase nên khi bổ sung chất chỉ thị là X-gal (5-bromo-4chloro- 3indolyl-beta-D-galactose pyranoside) enzyme β - galactosidase sẽ phân hủy chất chỉ thị theo phản ứng sau:
X-gal galactose + 4Cl-3-Br-indigo (có màu xanh)
Sau khi nuôi cấy qua đêm (16-18 giờ) ở nhiệt độ 370C sẽ xuất hiện hai loại khuẩn lạc trắng và xanh (Hình 3.4). Khuẩn lạc màu trắng là tế bào đã biến nạp thành công và có khả năng mang plasmid chứa đoạn DNA quan tâm (vì đoạn DNA này đã đƣợc chèn vào vị trí của gen mã hóa cho enzyme β - galactosidase). Khuẩn lạc màu xanh là tế bào đã biến nạp thành công nhƣng trong plasmid không chứa đoạn DNA quan tâm nên gen β - galactosidase vẫn hoạt động tạo ra enzyme phân hủy X - gal thành 4Cl-3-Br-indigo làm cho khuẩn lạc có màu xanh. Nhƣng những khuẩn lạc màu trắng chƣa chắc chắn là chứa plasmid tái tổ hợp với đoạn DNA quan tâm, trong trƣờng hợp này có thể do plasmid gắn với một đoạn gen DNA lạ khác nhiễm vào hoặc plasmid không đƣợc biến nạp vào trong tế bào. Để có kết quả chính xác phải tiếp tục sàng lọc khuẩn lạc.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.4. Kết quả biến nạp khuẩn lạc
3.5.3. Kết quả thực hiện phản ứng PCR từ khuẩn lạc
Sau khi thu đƣợc các dòng khuẩn lạc trắng, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra xem các khuẩn lạc đó có mang gen mong muốn hay không, vì cơ chế bắt màu trắng có thể do các nguyên nhân sau:
+ Plasmid không đƣợc biến nạp vào trong tế bào.
+ Plasmid gắn với một đoạn DNA lạ khác nhiễm vào biến, nạp thành công. + Plasmid có chứa đoạn gen quan tâm, biến nạp thành công.
Vì vậy trên đĩa chúng tôi chọn ngẫu nhiên một số mẫu khuẩn lạc trắng sau đó tiến hành Clony PCR từ khuẩn lạc, đây là phƣơng pháp cho phép phát hiện nhanh khuẩn lạc có mang plasmid, phƣơng pháp này đơn giản, ít tốn kém. Kỹ thuật này dựa trên kỹ thuật PCR thông thƣờng chỉ khác là DNA đƣợc thay thế bằng plasmid và mồi cũng đƣợc thay thế bằng mồi pUC18, vì vậy ta tiến hành thực hiện phản ứng có chu kỳ nhiệt giống phản ứng PCR, thể tích phản ứng 25μl (15μl nƣớc; 2,5μl đệm PCR 10X; 2,5μl MgCl2 25mM; 2,5μl dNTP 2,5mM; 1μl mỗi loại mồi pUC18-F và pUC18-R 50 pmol/μl; 0,5 μl Taq DNA polymerase 5U/μl; khuẩn lạc lấy trực tiếp từ đĩa thạch). Điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, kết quả điện di đƣợc thể hiện qua (Hình 3.5A và 3.5B), trên bảng điện di chỉ xuất hiện một băng vạch tƣơng ứng với kích thƣớc đoạn gen chèn vào plasmid.
Hình 3.5. (A). Kết quả Clony-PCR của các dòng của mẫu ĐA1 - ĐA15 với gen katG M: Thang chuẩn DNA 1kb
Hình 3.5. (B). Kết quả Clony-PCR của các dòng của mẫu: ĐO1-ĐO2-ĐO8-ĐO10- ĐO11-ĐO12 với gen katG, M: Thang chuẩn DNA 1kb
Tiến hành nuôi lỏng để tách plasmid. Sau khi chọn đƣợc khuẩn lạc trắng ta nuôi lỏng trong 3ml LB lỏng có chứa kháng sinh Carbenicilin tỉ lệ 1 : 1 ở 370C tủ lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong 16-18 giờ rồi lấy sản phẩm đi tách plasmid.
500bp
700bp 684bp
700bp 500bp
3.5.4. Kết quả kiểm tra gen đích bằng enzyme cắt giới hạn
Để khẳng định chắc chắn hơn liệu các đoạn gen inhA và katG đã đƣợc gắn vào vector tái tổ hợp chƣa, chúng tôi đã tiến hành cắt các vector này bằng enzyme cắt giới hạn.
Thành phần phản ứng cắt plasmid đƣợc thực hiện nhƣ phần 2.2.4. Điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.
3.5.4.1. Kết quả kiểm tra đối với gen katG.
Trên hình ảnh (Hình 3.6A và 3.6B), các plasmid có mang gen katG có độ dài khoảng 684bp thì sẽ xuất hiện hai băng. Một băng có kích thƣớc khoảng 684bp, là kích thƣớc của đoạn gen katG. Một băng có kích thƣớc khoảng 2,7kb, là kích thƣớc của vector pBT.
Thực hiện phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn BamHI xác định đoạn gen
katG trên 28 mẫu plasmid có 24 mẫu cho kết quả dƣơng tính, 4 mẫu kết quả âm tính. Các kết quả âm tính là do sai sót trong quá trình chọn lọc khuẩn lạc để nuôi lỏng tách plasmid.
Hình 3.6. (A.). Điện di sản phẩm cắt plasmid các dòng của mẫu: ĐA1-ĐA3-ĐA4-ĐA5-ĐA6-ĐA7-ĐA10: M: Thang chuẩn DNA 1kb
Hình 3.6.(B). Điện di sản phẩm cắt plasmid các dòng của mẫu: ĐO8-ĐO9-ĐO11- ĐO12- ĐA13-ĐA15: M: Thang chuẩn 1kb. 3.5.4.2. Kết quả kiểm tra đối với gen inhA
Trên hình ảnh điện di (Hình 3.7A và 3.7B), những plasmid có chứa đoạn gen
inhA sẽ xuất hai băng, một băng có kích thƣớc khoảng 501bp tƣơng ứng với kích thƣớc đoạn gen inhA, một băng có kích thƣớc 2,7kb chính là kích thƣớc của vector pBT.
Thực hiện cắt plasmid bằng enzyme BamHI để xác định đoạn gen inhA trên 55 dòng các mẫu ĐA và ĐO có 50 dòng thể hiện kết quả dƣơng tính và 5 dòng kết quả âm tính. Các kết quả âm tính này là do những sai sót trong quá trình lựa chọn mẫu để tách plasmid.
Hình 3.7.(A). Điện di sản phẩm cắt plasmid các dòng của mẫu ĐA1-ĐA3-ĐA4- ĐA5-ĐA6-ĐA7-ĐA10-ĐA11: M: Thang chuẩn 1kb
684 bp 500 bp 700 bp 250 bp 500 bp 2,7 kb 501 bp
Hình 3.7.(B). Điện di sản phẩm cắt plasmid các dòng của mẫu ĐO8- ĐO9-ĐO12- ĐA13-ĐA15: M thang chuẩn 1kb
Nhƣ vậy ta có thể kết luận đoạn gen katG và đoạn gen inhA đã đƣợc chèn vào vector pBT.
Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch của các mẫu plasmid cho thấy các dòng tế bào tăng sinh khá tốt và quá trình tinh sạch là đảm bảo chất lƣợng. Các tác giả khác khi sử dụng các bộ kit tinh sạch của các hãng nhƣ Fermentas, Promega...đều cho các kết quả tƣơng tự.
Nồng độ của DNA plasmid các mẫu nghiên cứu khá cao và đồng đều, trung bình đều trên 1000ng/μl, độ tinh sạch cao. Chứng tỏ quả trình tách plasmid đƣợc thực hiện tốt.
Kết quả tách chiết plasmid của chúng tôi đã khẳng định đoạn gen katG và
inhA đã đƣợc nhân lên với số lƣợng lớn trong tế bào vi khuẩn E.coli DH5α.
Các mẫu DNA plasmid thu đƣợc có đủ điều kiện về độ tinh sạch và nồng độ phục vụ cho giải trình tự gen.
3.6. Kết quả xác định trình tự và phát hiện đột biến trên gen katG liên quan đến tính kháng thuốc isoniazid ở các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu.
Các chủng vi khuẩn lao sau khi đọc trình tự đƣợc xử lý kết quả qua phần mềm BioEdit, so sánh trình tự nucleotide và acid amin từ các mẫu bệnh phẩm với trình tự nucleotide và acid amin của chủng dại H37Rv, chúng tôi đã thu đƣợc kết quả trong hình 3.8 và 3.9.
250 bp 500 bp
2,7 kb
Hình 3.8. So sánh trình tự nucleotide các mẫu bệnh phẩm với trình tự nucleotide của chủng dại H37Rv
Hình 3.9. So sánh trình tự acid amin các mẫu bệnh phẩm với trình tự acid amin của chủng dại H37Rv
Các kết quả phân tích những vị trí đột biến nucleotide trên gen katG và sự thay thế acid amin của các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu đƣợc tổng kết trong bảng 3.2 và 3.3.
Bảng 3.2. Các vị trí xảy ra đột biến nucleotide trên đoạn gen katG của các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu Vị trí Stt 636 640 654 656 658 664 684 702 718 721 724 776 817 831 846 864 916 938 ĐA1 ĐA3 GCG- TCG ATC- ATT* ĐA4 ĐA5 ĐA6 GGT- GGC* GAC- GGC ĐA7 GGT- GGC* CGG- TCG AAC- AAA CCG- CAG CTG- ATG GGG- GGC* GAC- TTA CCC- TCC ATG- CCT GGC- GGT* ĐA10 ĐA11 ĐA13 ĐA15
ĐO1 ACC- TCC ATC- ACC ĐO2 GGT- AGT CCC- CCT* ĐO8 GAT- GAC* ĐO9 ĐO10 ĐO11 ĐO12
Vị trí Stt 944 946 980 994 1054 1058 1060 1064 1072 1125 1147 1178 1184 1187 1201 1214 1219 ĐA1 AGC- ACC ĐA3 AGC- ACC ĐA4 AGC- ACC GGC- AGC ĐA5 ĐA6 AGC- ACC ĐA7 AGC- ACC CAA- TTT TAC- TTT ACC- TTC GCC- GTC ATC- ACC CGT- CCC CGC- CCC ĐA10 AGC- ACC ĐA11 AGC- ACC TTC- CTC ĐA13 AGC- AAC ĐA15 AGC- ACC GCC- GGG GAG- CAG
ĐO1 AGC- ACC CCG- CCT* TCG- CCG ĐO2 AGC- ACC GGC- AGC AAA- AGA ĐO8 ĐO9 ĐO10 ĐO11 ĐO12 CCC- TCC
Bảng 3.3. Các vị trí xảy ra đột biến thay thế acid amin của các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu