3. Nội dung nghiên cứu
2.3.1. Kỹ thuật tách chiết DNA từ các chủng vi khuẩn lao
Các bƣớc tiến hành đƣợc thực hiện tại Học viện Quân Y: DNA từ mẫu đờm của bệnh nhân đƣợc tách chiết phỏng theo phƣơng pháp của Chomezynski Sacchi (1987) [15].
DNA vi khuẩn lao
PCR gen katG Gắn gen katG vào plasmid pBT Đọc trình tự Amp Amp Thiết kế mồi katG So sánh và phân tích kết quả nhận đƣợc Xác định vị trí đột biến
Các bƣớc đƣợc thực hiện theo sơ đồ sau:
Cụ thể:
- Bệnh phẩm đƣợc xử lý bằng dung dịch Natri dichcloroisocyanurate 50% hoặc N-Acetyl L-Systein để đảm bảo tính an toàn. Sau đó đƣợc ly tâm 6000 vòng/ 30 phút để thu cặn (bệnh phẩm là đờm thì phải thêm 5ml dung dịch làm tan đờm, để ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút, lắc kỹ trƣớc khi ly tâm.).
- Rửa cặn thu đƣợc bằng cách thêm 5ml dung dịch PBS (phosphat Buffer Saline 1X,ly tâm 6000 vòng/15 phút.
Mẫu bệnh phẩm có chứa tế bào vi khuẩn lao
Phá vỡ tế bào vi khuẩn, loại bỏ các thành phần không mong muốn
Ly tâm lấy dịch tế bào
Tủa DNA
Tinh sạch DNA
- Thêm vào ống eppendorf có chứa cặn vi khuẩn 1000µl lysis buffer (Tris- HCl 1M, pH: 8,5 lấy 10ml, EDTA 0.5M: 1ml, SDS 10%: 2ml, NaCl 5M: 4ml, nƣớc khử ion vừa đủ 100ml) và 20µl lysozyme (25mg/ml).
- Ủ trong nƣớc đá 30 phút.
- Thêm 20µl proteinase K (10mg/ml), lắc kỹ.
- Ủ ở 560C trên bàn ủ có lắc trong 2 giờ (hoặc qua đêm).
- Thêm vào mỗi ống 1000µl phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol (tỷ lệ 1/1 với lysis buffer), lắc kỹ.
- Ly tâm 13000 vòng trong 10 phút. Lấy nƣớc nổi, bỏ ống chứa cặn sau ly tâm.
- Chuẩn bị trƣớc ống eppendorf có chứa 1000µl Ethanol 100% và 100µl CH3COONa 3M (đặt trong nƣớc đá).
- Hút nổi sau ly tâm sang ống eppendorf chuẩn bị ở trên, rồi lắc nhẹ ống vài lần, tiếp tục giữ trong lạnh ít nhất 3 giờ.
- Ly tâm 13000 vòng trong 10 phút, hút bỏ nƣớc nổi, lấy cặn.
- Rửa sạch bằng ethanol 70%, làm khô trong vaccumm dry 2-3 phút.
- Hòa cặn DNA trong 100µl nƣớc khử ion/ống để chuẩn bị chạy PCR và đo OD.
- Bảo quản ở 40C qua đêm, sau đó cất vào tủ -700C nếu chƣa dùng ngay.
2.3.2. Kỹ thuật PCR - Nhân dòng đoạn gen katG và gen inhA
1. DNA sau khi đƣợc tách chiết sẽ đo nồng độ DNA khuôn của các mẫu và sử dụng 100 ng/ thể tích 25µl phản ứng.
Thành phần Thể tích DNA 2µl dNTPs 2,5µl Primer reverse 1µl Primer forward 1µl PCR buffer 2,5µl Taq polymerase 0,25µl Nƣớc khử ion 10,75µl Tổng thể tích 25 µl
3. Thực hiện chu kỳ nhiệt (Hình 2.3)
Hình 2.3. Sơ đồ chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
4. Điện di kiểm tra kết quả trên gel 1%
5. Nhuộm Ethidium bromide và chụp kết quả trên máy Gel - DOC
2.3.3. Tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit của hãng AccuPrep@
Gel purification kit - Bioneer
Sau khi nhân bản thành công đọan gen nghiên cứu, chúng tôi đã tiến hành làm sạch (thôi gel) bằng Kit - Bioneer theo quy trình của hãng sản xuất:
950C 5 phút 950C 1 phút 550C 45 giây 720C 1 phút 720C 10 phút 40C ∞ 32 chu kỳ
Bƣớc 1: Xác định thể tích mẫu.
Bƣớc 2: Cho dung dịch Binding Buffer vào ống eppendorf chứa mẫu với lƣợng gấp 5 lần thể tích mẫu.
Bƣớc 3: Lắp cột tinh sạch vào ống eppendorf 2ml.
Bƣớc 4: Dùng pipet hút dịch chứa mẫu thực hiện ở bƣớc 2 vào cột tinh sạch (thể tích tối đa cho mỗi lần hút là 750µl).
Bƣớc 5: Ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong 1 phút. Đổ bỏ dịch chảy qua cột, DNA đƣợc giữ lại trên cột tinh sạch.
Bƣớc 6: Cho 500µl dung dịch Washing Buffer để rửa sạch DNA. Ly tâm 12000 vòng/phút trong vòng 1 phút. Đổ bỏ dịch chảy qua cột, giữ lại cột và ống.
Bƣớc 7: Lặp lại bƣớc 6.
Bƣớc 8: Ly tâm khô với tốc độ 12000 vòng/phút trong 2 phút. Bƣớc 9: Chuyển cột tinh sạch sang ống eppendorf 1,5ml.
Cho 30µl dung dich Elution Buffer vào cột tinh sạch, để yên 1 phút. Bƣớc 10: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút.